[发明专利]核酸检测和引物设计方法

说明书

本文提供了用于检测来自单细胞的靶核酸的方法。所述方法的优选实施方案包括在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列通常与细胞中的细胞DNA和RNA互补，所述细胞DNA包括基因组DNA。提供细胞样品，并且在优选实施方案中，所述样品来自单细胞。所述细胞被裂解，并且在单一反应中，可以检测DNA和RNA两者，而无需对所述样品进行细分。这可以通过提供与一种或多种靶核酸互补的核酸扩增引物组，特别是在扩增反应中选择性扩增特定靶核酸或扩增子的引物组来实现。还提供了用于这些方法的引物设计方法以及用于执行所述方法的设备和系统。

技术领域

本发明整体涉及检测细胞或生物体中的靶基因或核酸，更具体地涉及从单细胞中的一种或多种靶核酸中检测并识别DNA和RNA两者。

相关申请

本申请要求D.Dhingra和D.Ruff于2019年1月22日提交的题为“Method,Systemsand Apparatus for DNA and RNA Primer Design”的美国临时申请USSN 62/795,171的优先权。

背景技术

基于核酸核苷酸序列互补性的核酸分析方法可以直接分析遗传性状。因此，这些方法是识别遗传疾病、识别和监测癌症、微生物等的非常有力的手段。

当需要分析包含细胞DNA(包括基因组、染色体外、病毒和线粒体DNA)和RNA的多种靶核酸时，检测以极少量存在于样品中的靶基因或核酸(例如来自单细胞)是困难的并且变得甚至更成问题。

需要提供结合了与靶向DNA测序组合的靶向RNA测序的高通量单细胞核酸测序的方法、系统和设备。本文描述的发明满足了这些未解决的挑战和需求。

发明内容

本文描述和要求保护的发明具有多个属性和实施方案，包括但不限于在本发明内容中阐述或描述或引用的那些属性和实施方案。本文描述和要求保护的发明不限于本发明内容中识别的特征或实施方案，或受这些特征或实施方案的限制，这些特征或实施方案仅出于说明而非限制的目的包括在内。

在一方面，所公开的实施方案通常结合了与靶向DNA测序组合的靶向RNA测序。某些实施方案向单细胞测序工作流程提供基本上组合的靶向RNA测序和靶向DNA测序。在一个实施方案中，该方法基本上不需要将样品分成RNA和DNA部分。扩增产物(扩增子)在基因组与转录组之间可能有重叠覆盖。一些实施方案部分地通过选择具有特定序列或引物修饰的引物来提供选择性扩增DNA或RNA扩增子的方法。DNA和RNA扩增子也可以通过测序来区分并平衡每个扩增子的最佳测序深度。

在另一方面，提供了设计并提供用于选择性或优先扩增DNA或RNA扩增子的引物的方法。扩增引物还可以在骨架、核苷酸或其他地方包含基于序列或靶核酸类型(例如mRNA或gDNA)而影响(例如减少、阻止或限制)特定扩增子的扩增的化学修饰。

例如，在一些实施方案中，设计并提供引物，其中DNA反向引物被阻断以便在PCR之前不延伸。在其他实施方案中，DNA反向引物和正向引物被阻断。在其他实施方案中，扩增反应使DNA反向引物和正向引物被阻断，以便在PCR之前不延伸。

某些实施方案利用具有替代化学性质的固体珠粒，其中用于DNA和RNA两者的正向引物均在溶液中。在这些实施方案中，正向引物含有嵌入的PCR退火序列或‘柄(handle)’，其允许与引物杂交。柄是靶序列上游5’的特定尾部。此柄与珠粒条形码寡核苷酸互补，并充当PCR延伸桥，以将靶扩增子连接到珠粒条形码文库引物序列。固体珠包含可以与正向引物上的PCR柄退火的引物。基因特异性RNA反向引物和基因特异性DNA反向引物在溶液中。RNA反向引物可用于逆转录。在特定的实施方案中，DNA反向引物被阻断以便在PCR之前不延伸。本文描述的方法在可以产生的唯一核酸标记的数量方面实际上是不受限制的。