[发明专利]核酸检测和引物设计方法

权利要求书

1.一种用于检测来自单细胞的靶核酸的方法，所述方法独立于所呈现的顺序包括以下步骤：

i)在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列与细胞中的核酸互补；

ii)提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；

iii)将经包封的细胞与液滴中的所述蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；

iv)提供一个或多个核酸扩增引物组，其中每个引物组与靶核酸互补并且核酸扩增引物组的至少一个引物包含条形码识别序列；

v)执行核酸扩增反应以从单细胞的所述核酸形成扩增产物，所述扩增产物包含一个或多个靶核酸序列的扩增子；

vi)提供包含与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与所述识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；

vii)使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的所述扩增产物在足以使所述亲和试剂与所述靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触；以及

viii)通过对第一条码和第二条码进行测序来确定所述靶核酸的身份。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是DNA或RNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中DNA和RNA扩增产物均由所述靶核酸序列产生。

4.根据权利要求1所述的方法，其包括添加逆转录酶聚合酶并包括从RNA靶序列产生cDNA的步骤，在此步骤中，检测并识别来自单细胞的RNA靶核酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所提供的所述一个或多个核酸扩增引物组包含在添加逆转录酶之前被阻断的DNA特异性引物。

6.根据权利要求5所述的方法，其包括提供在任何逆转录酶活性期间被阻断的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。

7.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述RNA反向引物之外的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸可以包括DNA和RNA两者，并且选择性扩增DNA或RNA以形成对DNA或RNA靶核酸具有特异性的扩增子产物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在形成细胞裂解物之后通过加热使步骤iii)中的所述蛋白酶失活。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增期间通过使用选择性调节DNA或RNA扩增子扩增的竞争物来衰减、限制或阻止DNA或RNA扩增子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增期间通过使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的生物素化引物来衰减、限制或阻止DNA或RNA扩增子。

12.根据权利要求1所述的方法，其中为RNA扩增而提供的文库引物的一部分包含尿嘧啶并且能够通过裂解而去除RNA扩增子。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iv)中，每个引物组包含与靶核酸或其互补物互补的正向引物和反向引物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中正向引物包含识别条形码序列。