[发明专利]甘露糖的酶法生产

说明书

本文公开了生产甘露糖的改进方法，包括由M6PP催化将M6P转化为甘露糖的步骤，所使用的酶与先前生产甘露糖的方法中使用的M6PP酶类相比具有更高的活性。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年2月12日提交的申请号为62/804,426的美国申请的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及D-甘露糖生产的生物技术领域。更具体地，本发明提供了能够将糖类(例如，多糖、寡糖、二糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖)酶促转化为D-甘露糖的改进的D-甘露糖制备方法。

背景技术

D-甘露糖(以下称为甘露糖)是一种带温和甜味的、天然存在的单糖，存在于许多水果、蔬菜、植物材料甚至人体中。甘露糖拥有多种健康益处和药物应用。例如，甘露糖可用于治疗碳水化合物缺陷型糖蛋白综合征1b型，以及更常见的尿路感染。此外，甘露糖是一种得到验证的益生元，其不会使血糖水平升高，并具有抗炎特性。此外，它已被证明可以提高猪的胴体产量，并且是一种广泛用于护肤产品的辅助保湿剂。因此，甘露糖在制药、化妆品、消费品(饮料、食品、乳制品、糖果等)以及畜牧业中有着诸多应用。然而，由于甘露糖的售价较高，其在日常用品中的使用受到了限制。

目前，甘露糖主要通过从植物中提取来生产。常见的方法包括酸水解、热水解、酶水解、微生物发酵水解及这些方法的混合。不太常见的方法包括化学和生物转化。总的来说，这些方法的缺点是条件苛刻、资本支出高、原料成本高、从异构化反应中分离甘露糖的成本高以及产品收率相对较低(15-35％)。

需要开发一种用于高产量甘露糖生产的成本效益好的合成途径，其中该方法的至少一个步骤涉及能量上有利的化学反应。此外，需要一种生产方法，其中的方法步骤可以在一个罐或生物反应器中进行。还需要一种可以在相对低浓度的磷酸盐中进行的甘露糖生产方法，其中磷酸盐可以被循环利用，和/或该方法无需使用三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸盐的来源。还需要一种甘露糖生产途径，该途径无需在任何反应步骤中使用昂贵的烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD(H))辅酶。

公开号为WO 2018/169957的国际专利申请描述了D-甘露糖的酶促合成，该方法包括由甘露糖6-磷酸磷酸酶催化，将甘露糖6-磷酸(M6P)催化转化为甘露糖。然而，尽管在甘露糖酶法生产方面有所改进，仍然希望和需要提供进一步改进的甘露糖生产方法，例如，以少量的酶提供更高的产量。降低甘露糖生产的成本具有很强的工业和商业利益，这种成本的降低涉及使用减少量的酶和使用更有效的酶组合。

发明内容

一方面，本发明提供了一种改进的D-甘露糖制备方法，其能够将糖类(例如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖)酶促转化为D-甘露糖。本发明用于由糖类生产甘露糖的改进方法包括由甘露糖-6-磷酸磷酸酶(M6PP)催化，将甘露糖-6-磷酸(M6P)转化为甘露糖的步骤，其中M6PP包含具有与SEQ ID NO:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些方法中，甘露糖是在具有将果糖6-磷酸(F6P)转化为甘露糖6-磷酸(M6P)步骤的方法中制备，其中该步骤由甘露糖6-磷酸异构酶(M6PI)进行催化。在一些方面，该方法包括将葡萄糖6-磷酸(G6P)转化为F6P，其中该步骤由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)进行催化。在进一步方面，G6P被转化为F6P，然后通过一种酶转化为M6P，该酶为双功能磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶(PGPMI)。在其他方面，甘露糖合成方法还包括将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为G6P的步骤，并且该转化步骤由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)进行催化。