[发明专利]高覆盖率STLFR

说明书

本文描述的是高覆盖率单管长片段读取(stLFR)技术，其使用并对在共条形码化之前已被扩增的靶DNA片段执行stLFR，这为测序提供了更高的DNA量并增加了测序覆盖率。在一些实施方案中，本申请中描述的高覆盖率stLFR使用两轮stLFR。在一些实施方案中，用转位子使靶DNA片段转位，该转位子具有可用于对序列读段排序的特定位置条形码。

对相关申请的交叉引用

本申请要求2019年1月29日提交的美国临时申请号62/798,378和2019年5月6日提交的美国临时申请号62/843,972的优先权。这两个临时申请的内容通过引用并入本文以用于所有目的。

背景技术

迄今为止，绝大多数个体全基因组序列缺乏关于作为同源染色体上的连续块传输的单碱基到多碱基变体的顺序的信息。最近开发了许多技术来实现这一点。大多数是基于共条形码化(co-barcoding)的过程(Peters等人,Frontiers in Genetics 5,466(2014))，即将相同的条形码(barcode)添加到单个长基因组DNA分子的亚片段中。测序后，条形码信息可用于确定哪些读段源自原始长DNA分子。该过程首先由Drmanac(WO2006/138284A2(2006))描述，并由Peters等人(Peters等人,Nature 487,190-195(2012))实施为384孔板测定，后来在Drmanac(US 2014/0323316)和Wang等人,BioRxiv,2018年6月29日,doi:https//doi.org/10.1101/357863中以单一反应容器格式实施。

发明内容

一种用于制备用于确定靶核酸的序列的条形码化多核苷酸文库的方法，该方法包括：

(a)提供源自靶核酸的片段，其中片段是双链或部分双链的；

(b)将交错的单链断裂引入至少一些双链片段，由此产生多个第一复合物，其中每个第一复合物包含多个第一亚片段，以及

(c)将第一捕获寡核苷酸序列与第一亚片段中的至少一些进行关联，

其中每个第一捕获寡核苷酸序列包含第一条形码，并且任选地包含启动子序列或引物结合序列，以及

其中关联包括将(a)中的双链片段或(b)中的复合物与多个个体第一珠组合，其中每个个体第一珠包含固定在其上的多个第一捕获寡核苷酸，其中每个捕获寡核苷酸包含第一捕获寡核苷酸序列，其中固定在每个个体第一珠上的第一捕获寡核苷酸包含相同的第一捕获寡核苷酸序列，其中大多数不同的第一珠具有固定在其上的不同的第一捕获寡核苷酸，并且其中每个不同的第一捕获寡核苷酸序列包含不同的第一条形码，

由此提供条形码化第一亚片段；

(d)扩增条形码化第一亚片段的至少一部分以产生扩增的条形码化第一亚片段，其中扩增的条形码化第一亚片段是双链或部分双链的；

(e)将交错的单链断裂引入扩增的条形码化第一亚片段中的一些中以生成第二复合物，该第二复合物各自包含多个第二亚片段；以及

(f)将第二捕获寡核苷酸序列与第二亚片段中的至少一些进行关联；

其中关联包括将(d)中扩增的条形码化第一亚片段或(e)中的第二复合物与多个个体第二珠组合，其中每个个体第二珠包含固定在其上的多个第二捕获寡核苷酸，其中每个第二捕获寡核苷酸包含第二捕获寡核苷酸序列，其中固定在每个个体第二珠上的第二捕获寡核苷酸包含相同的第二捕获寡核苷酸序列，其中大多数不同的第二珠具有固定在其上的不同的第二捕获寡核苷酸，并且其中每个不同的第二捕获寡核苷酸序列包含不同的第二条形码，

由此提供条形码化第二亚片段文库。

一种用于制备用于确定靶核酸的序列的条形码化多核苷酸文库的方法，该方法包括：

(a)提供源自靶核酸的片段，其中片段是双链或部分双链的；

(b)将交错的单链断裂引入至少一些双链片段，由此产生多个第一复合物，其中每个第一复合物包含多个第一亚片段，以及

(c)将第一捕获寡核苷酸序列与第一亚片段中的至少一些进行关联，