[发明专利]高覆盖率STLFR

权利要求书

1.一种用于制备用于确定靶核酸的序列的条形码化多核苷酸文库的方法，所述方法包括：

(a)提供源自所述靶核酸的片段，其中所述片段是双链或部分双链的；

(b)将交错的单链断裂引入至少一些双链片段中，由此产生多个第一复合物，其中每个第一复合物包含多个第一亚片段，以及

(c)将第一捕获寡核苷酸序列与所述第一亚片段中的至少一些进行关联，

其中每个第一捕获寡核苷酸序列包含第一条形码，并且任选地包含启动子序列或引物结合序列，以及

其中所述关联包括将(a)中的所述双链片段或(b)中的所述复合物与多个个体第一珠组合，其中每个个体第一珠包含固定在其上的多个第一捕获寡核苷酸，其中每个捕获寡核苷酸包含第一捕获寡核苷酸序列，其中固定在每个个体第一珠上的所述第一捕获寡核苷酸包含相同的第一捕获寡核苷酸序列，其中大多数不同的第一珠具有固定在其上的不同的第一捕获寡核苷酸，并且其中每个不同的第一捕获寡核苷酸序列包含不同的第一条形码，

由此提供条形码化第一亚片段；

(d)扩增条形码化第一亚片段的至少一部分以产生扩增的条形码化第一亚片段，其中所述扩增的条形码化第一亚片段是双链或部分双链的；

(e)将交错的单链断裂引入所述扩增的条形码化第一亚片段中的一些中以生成第二复合物，所述第二复合物各自包含多个第二亚片段；以及

(f)将第二捕获寡核苷酸序列与所述第二亚片段中的至少一些进行关联；

其中所述关联包括将(d)中所述扩增的条形码化第一亚片段或(e)中的所述第二复合物与多个个体第二珠组合，其中每个个体第二珠包含固定在其上的多个第二捕获寡核苷酸，其中每个第二捕获寡核苷酸包含第二捕获寡核苷酸序列，其中固定在每个个体第二珠上的所述第二捕获寡核苷酸包含相同的第二捕获寡核苷酸序列，其中大多数不同的第二珠具有固定在其上的不同的第二捕获寡核苷酸，并且其中每个不同的第二捕获寡核苷酸序列包含不同的第二条形码，

由此提供条形码化第二亚片段文库。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亚片段的平均长度在大小上是第二亚片段的平均长度的至少2倍。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)在单一混合物中进行，其中所述单一混合物中第一珠的数量大于靶核酸片段的数量，并且其中每个第一珠包含固定在其上的所述第一捕获寡核苷酸的多个副本。

4.如权利要求3所述的方法，其中在步骤(b)中通过接合或通过合成将第一插入寡核苷酸添加到至少一些第一亚片段中，并且其中步骤(c)还包括：

(1)将所述第一捕获寡核苷酸接合至所述第一插入寡核苷酸，或

(2)将第一捕获寡核苷酸与所述第一插入寡核苷酸杂交，然后通过DNA聚合酶延伸所述插入寡核苷酸以并入第一条形码。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(f)在单一混合物中进行，并且其中所述单一混合物中第二珠的数量大于所述扩增的条形码化第一亚片段的数量，其中每个第二珠包含固定在其上的所述第二捕获寡核苷酸的多个副本。

6.如权利要求5所述的方法，其中至少一些第二亚片段中的每个连接至第二插入寡核苷酸，并且其中步骤(e)还包括：

(1)将所述第二捕获寡核苷酸接合至所述第二插入寡核苷酸，或

(2)将所述第二捕获寡核苷酸与所述第二插入寡核苷酸杂交，然后通过DNA聚合酶延伸所述插入寡核苷酸以并入第二条形码。

7.如权利要求4所述的方法，其中通过转位引入所述第一插入寡核苷酸。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述第二插入寡核苷酸通过转位引入。

9.如权利要求7所述的方法，其中步骤(c)还包括向反应中添加第一夹板寡核苷酸，其中所述第一插入寡核苷酸包含与所述第一夹板寡核苷酸的第一部分互补的第一杂交序列，并且其中所述捕获寡核苷酸包含与所述第一夹板寡核苷酸的第二部分互补的共同序列。