[发明专利]多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用

说明书

本发明提供了多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用。支持物包括支持物本体以及位于支持物本体表面和/或内部的多种核酸标记，单个支持物上标记的核酸至少包括：一或多个第一核酸标记，其作用至少包括捕获反应体系中的特定化合物到支持物表面；一或多个第二核酸标记，其作用至少包括可以参与到捕获到支持物表面的特定化合物的指定生物化学反应过程。本发明的多种核酸共标记的支持物可以用于5’单细胞RNA表达谱分析、构建微孔阵列平台的5’单细胞VDJ文库、构建3’单细胞RNA文库、构建单细胞转录组文库、单细胞多组学研究、多重PCR和/或构建多重PCR测序文库等。

技术领域

本发明是关于一种多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用。

背景技术

传统的核酸分子反应，包括核酸杂交、延伸、扩增等反应都是在液相中进行的，液相为参与反应的核酸和酶反应提供了均一稳定的环境从而能够最大化产出。随着生物研究的逐渐深入，科学家发现将参与反应的核酸或者酶连接到固相表面可以赋予核酸空间位置信息从而更方便纯化、分离、检测与分析，因此开发出越来越多的固相核酸反应用于核酸序列分析和核酸定量，例如寡核苷酸有序固定在基质上的核酸芯片技术、应用于二代基因测序的桥式扩增和微球乳液扩增技术、应用于高通量单细胞测序的核酸编码微珠等。

单核苷酸多态(SNP)作为遗传标记广泛应用于群体基因组学、全基因组关联研究(GWAS)、亲子鉴定和人群鉴定。传统的SNP鉴定技术可以同时分析数百个以内的位点，包括TaqMan荧光分析、KASPar鉴定技术以及直接PCR测序技术，优点在于在待检测SNP位点数量较少时实验操作灵活，缺点是单个样本待检测SNP数量多时(尤其≥50)成本线性增加；包括生物芯片和高通量测序在内的新检测技术可以实现10³-10⁶个SNP的鉴定，例如RAD测序(restriction site associated DNA sequencing)、外显子测序和全基因组测序，其缺点在于单个样本检测建库与测序成本较高，尤其在单个样本检测SNP数量少于1000时单个SNP平均检测成本迅速增加；当单个样本待检测SNP数量在20-1000时使用多重PCR建库结合二代测序能够有效地降低单SNP平均检测成本。

多重PCR建库一般是指在PCR扩增体系中加入多对PCR引物以同时扩增多个目标片段，然后通过第二步通用引物扩增形成具有测序仪要求的含有接头和样本标签的核酸文库。由于在PCR扩增体系中加入较高浓度的多对引物，多重PCR容易形成大量的引物二聚体，而引物二聚体会直接影响构建文库的质量，所以如何去除引物二聚体成为多重PCR建库中的关键环节。据公开报道，Zuiyi Yang等人通过优化引物对序列可以降低多重PCR的引物二聚体，Integrated DNA Technologies公司、Adaptive Biotechnology公司以及KennethJ.Livak实验室利用RNaseH依赖的PCR原理对多重PCR引物进行RNA碱基修饰也可以有效的降低反应过程中的引物二聚体。虽然引物二聚体可以通过以上披露的方法以及PCR后纯化去除，多重PCR还存在扩增目标区效率不同导致的PCR偏差以及引物对交叉组合导致的非特异扩增等问题。更重要的是，由于在液相条件中不同引物对的PCR扩增目标区域不能重叠，普通多重PCR很难在液相体系中实现单反应管长片段DNA的连续序列分析。

众所周知复杂的生命机体由许多性质特异的细胞组成，在特定的状态下每个细胞表达的核酸和蛋白的种类与数量都有所不同，所以在单细胞水平上检测核酸和蛋白指标对生物医学研究有重要意义。单细胞测序从检测指标来看主要有单细胞基因组测序、单细胞RNA测序、单细胞表观基因组测序及空间单细胞测序；从检测通量来看主要分为低通量单细胞测序(一次检测1-500细胞)和高通量单细胞测序(一次检测1000-10000细胞)。