[发明专利]一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用，属于生物制剂技术领域，所述制备方法包括以下步骤：培养人脐带间充质干细胞，得到含外泌体上清；采用化学沉淀法对所的含外泌体上清进行分离，得到含蛋白激酶的MSC外泌体。本发明的制备方法制备得到的人脐带间充质干细胞来源的外泌体含有蛋白激酶，包含蛋白激酶的外泌体能够增强AMPK活性和/或抑制肝细胞脂肪变性，从而能够治疗非酒精性脂肪肝。

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用。

背景技术

人脐带间充质干细胞是一类具有多向分化能力和自我更新能力的干细胞。它在胚胎时期的第4～12天进入Wharton’sjelly并且活跃至胎儿娩出。因脐带具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、伦理和法律方面的问题等诸多优点，被广泛用于hUC-MSCs的提取。同时，研究发现hUC-MSCs的体外扩增和多向分化能力比其他组织来源的MSCs更强。外泌体是一种由真核细胞分泌到细胞外的、直径约30～100nm的膜性小囊泡，含有其来源细胞的胞膜、蛋白质、和微小RNA(miRNA)等成分，通过与邻近的细胞膜融合进而将一个细胞的胞内物质传递到另一个细胞，从而在不同细胞间进行信息传递。现有技术中公开了将人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于免疫调节、修复皮肤损伤以及视网膜神经元细胞修复等，但还没有将人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于治疗非酒精性脂肪肝的记载和报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用，本发明制备得到的人脐带间充质干细胞来源的外泌体能够用于制备治疗非酒精性脂肪肝的药物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)将人脐带间充质干细胞接种至含胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行第一扩增培养，至细胞融合至70％～80％时，转接细胞至无血清培养基进行第二扩增培养45～50h，收集上清，得到含外泌体上清；

2)将所述含外泌体上清于1800～2200g第一离心25～35min，收集第一上清；将所述第一上清于8000～12000g第二离心25～35min，收集第二上清；将所述第二上清于1400～1600g第三离心25～30min，收集第三上清；

3)将所述第三上清和exosome提取试剂混合，于1～5℃条件下提取9～16h，得到提取液；将所述提取液于1400～1600g离心25～30min，收集沉淀，重悬沉淀，得到人脐带间充质干细胞来源的外泌体。

优选的，步骤1)中所述人脐带间充质干细胞包括3～5代人脐带间充质干细胞。

优选的，步骤1)中所述低糖DMEM培养基中胎牛血清的体积百分含量为8％～12％。

优选的，步骤1)中所述第一扩增培养和第二扩增培养的温度独立为35～38℃；所述第一扩增培养和第二扩增培养的二氧化碳浓度独立为4％～6％。

优选的，步骤4)中所述重悬沉淀采用的试剂包括磷酸缓冲盐溶液。

优选的，所述重悬沉淀后，还包括依次对重悬液进行洗涤和0.22μm无菌滤膜过滤。

本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的人脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

优选的，所述人脐带间充质干细胞来源的外泌体通过增强AMPK活性和/或抑制肝细胞脂肪变性来治疗非酒精性脂肪肝。