[发明专利]一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用

说明书

一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用，属于基因工程技术领域。为了解决目前对于12种呼吸道病毒生物分类困难，特异性差的难题，本发明对NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息的分析，得到特异性高、保守性好的各呼吸道病毒的基因作为靶基因，并根据靶基因设计多重引物和探针，进而通过优化获得多重PCR反应体系，得到了一种可以快速检测12种呼吸道病毒的方法，利用该方法可以实现通过一次PCR快速检测出样品中是否含有12种呼吸道病毒。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用。

背景技术

传染病是一类让国际卫生组织及各大医院、疾病控制中心对之时刻保持高度警惕的一类疾病，可以在人与人，动物与动物，人与动物之间相互感染传播。传染病的暴发和流行对人类的生命财产构成了巨大的威胁，传染病可以在很短时间内就能在全球各个城市大范围的流行，严重威胁人类。尤其是呼吸道病毒引发的疾病，如何高效鉴别疑似，做到“早发现，早诊断，早隔离，早治疗”，成为病毒感染治疗的关键手段；尤其是2020年新冠病毒的出现和暴发，让我们认识到病毒分类和检测的重要意义。

发明内容

本发明为了解决目前对于12种呼吸道病毒生物分类困难，特异性差的难题，提供了一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一、通过分别对NCBI已发布的12种呼吸道病毒的基因组信息的分析，得到具有特异性高和保守性的各呼吸道病毒的基因作为靶基因；

步骤二、基于步骤一获得的靶基因设计多重引物及探针；

步骤三、利用步骤二获得的多重引物进行多重PCR反应体系及条件的优化，获得多重PCR反应体系和条件。

进一步地限定，所述12种呼吸道病毒为：2019-nCoV、HCoV229E、HCoVOC43、HCoVNL63、SARS、MERS、HKU1、RNA人偏肺病毒、RNA甲型流感病毒、RNA乙型流感病毒、RNA副流感病毒和RNA呼吸道合胞病毒。

进一步地限定，步骤一所述靶基因的获得方法具体为：

(1)对NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息分别进行共线性分析，得到基因组中特异性的基因；

(2)通过比较基因组学分析确定基因组中特异性基因与NCBI库中不具有同源特异性的序列作为候选基因；

(3)将候选基因在目的病毒基因组数据中进行检索，确定上下游基因保守性，避开高突变区域，用简并碱基的形式标注出变异性的碱基；

(4)对候选基因进行验证，将具有特异性和保守性的候选序列作为靶基因。

进一步地限定，步骤二所述多重引物为：

2019-nCov病毒靶基因的上下游引物：

2019-nCoV ORF1ab 1 W1 F序列如SEQ ID No.1所示；

2019-nCoV ORF1ab 1 W1 R序列如SEQ ID No.2所示；

2019-nCoV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.3所示；

2019-nCoV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.4所示；

HCoV229E病毒靶基因的上下游引物：

HCoV229E N 1 W1 F序列如SEQ ID No.5所示；

HCoV229E N 1 W1 R序列如SEQ ID No.6所示；

HCoVOC43病毒靶基因的上下游引物：