[发明专利]一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用

权利要求书

1.一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、通过分别对NCBI已发布的12种呼吸道病毒的基因组信息的分析，得到具有特异性和保守性的各呼吸道病毒的基因作为靶基因；

步骤二、基于步骤一获得的靶基因设计多重引物及探针；

步骤三、利用步骤二获得的多重引物进行多重PCR反应体系及条件的优化，获得多重PCR反应体系和条件。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述12种呼吸道病毒为：2019-nCoV、HCoV229E、HCoVOC43、HCoVNL63、SARS、MERS、HKU1、RNA人偏肺病毒、RNA甲型流感病毒、RNA乙型流感病毒、RNA副流感病毒和RNA呼吸道合胞病毒。

3.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤一所述靶基因的获得方法具体为：

(1)根据NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息，查找每类病毒的不同的基因组序列，然后使用DNAMAN软件对基因组序列进行序列比对；

(2)检索出基因组特异性的基因，并且利用blast软件和nt数据库进行比对，确定基因组中特异性基因与NCBI库中不具有同源特异性的序列作为候选基因；

(3)将候选基因在目的病毒基因组数据中进行检索，确定上下游基因保守性，避开高突变区域，用简并碱基的形式标注出变异性的碱基；

(4)对候选基因进行验证，将具有特异性和保守性的候选序列作为靶基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述不具有同源特异性是指同源性不高于60％。

5.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤二所述多重引物为：

2019-nCov病毒靶基因的上下游引物：

2019-nCoV ORF1ab 1 W1 F序列如SEQ ID No.1所示；

2019-nCoV ORF1ab 1 W1 R序列如SEQ ID No.2所示；

2019-nCoV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.3所示；

2019-nCoV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.4所示；

HCoV229E病毒靶基因的上下游引物：

HCoV229E N 1 W1 F序列如SEQ ID No.5所示；

HCoV229E N 1 W1 R序列如SEQ ID No.6所示；

HCoVOC43病毒靶基因的上下游引物：

HCoVOC43 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.7所示；

HCoVOC43 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.8所示；

HCoVNL63病毒靶基因的上下游引物：

HCoVNL63 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.9所示；

HCoVNL63 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.10所示；

SARS病毒靶基因的上下游引物：

SARS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.11所示；

SARS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.12所示；

MERS病毒靶基因的上下游引物：

MERS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.13所示；

MERS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.14所示；

HKU1病毒靶基因的上下游引物：

HKU1 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.15所示；

HKU1 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.16所示；

RNA人偏肺病毒靶基因的上下游引物：

HMPV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.17所示；

HMPV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.18所示；

RNA甲型流感病毒靶基因的上下游引物：

H3N2 M 1 W1 F序列如SEQ ID No.19所示；

H3N2 M 1 W1 R序列如SEQ ID No.20所示；

H1N1 HA 2 W1 F序列如SEQ ID No.21所示；

H1N1 HA 2 W1 R序列如SEQ ID No.22所示；

H3N2 HA 1 W1 F序列如SEQ ID No.23所示；

H3N2 HA 1 W1 R序列如SEQ ID No.24所示；

H1N1 M 2 W1 F序列如SEQ ID No.25所示；

H1N1 M 2 W1 R序列如SEQ ID No.26所示；

RNA乙型流感病毒靶基因的上下游引物：

IFB NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.27所示；

IFB NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.28所示；

IFB NP 2 W1 F序列如SEQ ID No.29所示；

IFB NP 2 W1 R序列如SEQ ID No.30所示；

RNA副流感病毒靶基因的上下游引物：

HPIV4 NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.31所示；

HPIV4 NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.32所示；

RNA呼吸道合胞病毒靶基因的上下游引物：

RSV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.33所示；

RSV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.34所示。