[发明专利]固定化乙酰胆碱酯酶的制备及其在筛选和鉴定酶抑制剂中的应用

说明书

本发明提供固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，采用多巴胺修饰纤维素滤纸，再通过迈克尔加成/席夫碱反应，将乙酰胆碱酯酶共价结合在纤维素滤纸上，即得固定化乙酰胆碱酯酶。本发明还提供其在筛选和鉴定乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。本发明的固定化乙酰胆碱酯酶具有稳定性好、耐pH和耐温范围广、酶活力强、利用率高、易于控制、制备成本低、适合大规模制备、高通量筛选酶抑制剂等优点。

技术领域

本发明属于新药筛选化学工艺技术领域，具体涉及固定化乙酰胆碱酯酶的制备及其在筛选和鉴定酶抑制剂中的应用。

背景技术

酶是一类生物催化剂，广泛存在于生命体的各个细胞内，参与促进了生物体新陈代谢的正常运转，从而维持了一切生命活动。目前，酶因其在催化反应中具有专一性强、条件温和、催化效率高等特点，已成为分析化学、药物筛选、临床医学等相关学科的重要研究对象和靶标。酶抑制剂可有效降低与疾病相关酶的活性，从而进行疾病的预防和治疗，现已有许多酶抑制剂类药物用于相关疾病的治疗。虽然大多数酶抑制剂类药物可以在临床上缓解或减轻疾病的症状，但是这些药物(如乙酰胆碱酯酶抑制剂，多奈哌齐、加兰他敏、利斯的明和塔克林)疗效有限、价格昂贵、并且存在副作用，严重地制约了其应用。天然产物(如植物、传统中药、民族药物和食品等)具有资源丰富、安全有效、环境友好和毒副作用小等特点，是天然酶抑制剂的重要来源之一。因此，通过建立不同的模型从天然产物中筛选酶抑制剂已经成为了发现新药的重要手段。

目前，酶抑制剂的筛选方法包括体外酶活性抑制法、生物亲和色谱法和酶-配体亲和结合法。其中，酶-配体亲和结合法是以受体(酶)与配体(活性小分子化合物)亲和结合为原理的筛选方法，被认为是一种从复杂基质中筛选活性化合物快速、简便且有效的方法。酶-配体亲和结合法所涉及到的受体包括游离酶和固定化酶，其中，因固定化酶稳定性好、耐pH和耐温范围广、可重复使用和能快速从反应体系中分离等特点，受到越来越多的关注。通常的固定化酶载体(如磁性材料)需要通过离心、过滤或特殊环境/设备等，才能实现固定化酶与反应体系的分离。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术的缺陷，提供固定化乙酰胆碱酯酶的制备及其在筛选和鉴定酶抑制剂中的应用。旨在解决自由酶稳定性差、酶载体材料昂贵且不易得、酶固定化过程繁琐、固定化酶与反应体系分离困难、酶利用率低、样品和溶剂消耗量大、劳动强度高、不适用于多种成分的同时筛选等问题。本发明中所述的纤维素滤纸作为一种新型的酶固定化载体，具有价格低廉，无需制备，酶固定化的制备过程简单，尤其是可即时分离，避免了分离过程中繁琐的离心或过滤操作的优点。并且本发明所建立的固定化乙酰胆碱酯酶结合高效液相-飞行时间质谱模型，具有快速、高效、高灵敏度、低样品/酶消耗、高通量、酶利用率高等特点，可以实现从天然产物中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂，该发明在酶抑制剂筛选方面具有重要的科学价值及实用价值。

本发明提供固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法，采用多巴胺修饰纤维素滤纸，再通过迈克尔加成/席夫碱反应，将乙酰胆碱酯酶共价结合在纤维素滤纸上，即得固定化乙酰胆碱酯酶。

作为优选，所述采用多巴胺修饰纤维素滤纸的具体方法为：将盐酸多巴胺溶解在磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1～5mg/mL多巴胺缓冲溶液，将纤维素滤纸浸没于含有多巴胺缓冲溶液的容器中，密封，置于25～50℃的恒温振荡器中，反应1～15小时后取出，超纯水清洗至中性，烘干。

作为优选，所述将乙酰胆碱酯酶共价结合在纤维素滤纸上的具体方法为：将修饰后的纤维素滤纸置于含有乙酰胆碱酯酶的容器中，密封，置于25～50℃的恒温振荡器中，反应1.5～5.5小时后取出，使用磷酸盐缓冲液洗涤并烘干。

本发明提供固定化乙酰胆碱酯酶，是应用上述的制备方法制备得到的。

本发明提供上述的固定化乙酰胆碱酯酶在筛选和鉴定乙酰胆碱酯酶酶抑制剂中的应用。

本发明提供一种筛选和鉴定酶抑制剂的方法，包括以下步骤：