[发明专利]固定化乙酰胆碱酯酶的制备及其在筛选和鉴定酶抑制剂中的应用

权利要求书

1.固定化乙酰胆碱酯酶在筛选和鉴定乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用；

所述固定化乙酰胆碱酯酶的制备方法为：将盐酸多巴胺溶解在磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1 ~ 5 mg/mL多巴胺缓冲溶液，将纤维素滤纸浸没于含有多巴胺缓冲溶液的容器中，密封，置于25 ~ 50 ℃的恒温振荡器中，反应1 ~ 15小时后取出，超纯水清洗至中性，烘干；将修饰后的纤维素滤纸置于含有乙酰胆碱酯酶的容器中，密封，置于25 ~ 50 ℃的恒温振荡器中，反应1.5 ~ 5.5小时后取出，使用磷酸盐缓冲液洗涤并烘干，即得固定化乙酰胆碱酯酶；

所述应用具体为：

（1）以石杉碱甲A作为阳性对照物，以没食子酸和阿魏酸作为阴性对照物，将阳性对照物和阴性对照物混合制备成人工混合模型溶液，将上述的固定化乙酰胆碱酯酶置于人工混合模型溶液中进行孵育，孵育结束后，用pH为9的磷酸盐缓冲液清洗固定化酶纸片并弃去滤液，用体积百分比为50%的甲醇水溶液洗脱并收集滤液，通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行验证，若从滤液中筛选出阳性对照物则证明成功制备固定化乙酰胆碱酯酶；

（2）将上述阳性对照物加入到待测样品溶液中，制备得到酶抑制剂模型溶液，将上述的固定化乙酰胆碱酯酶置于酶抑制剂模型溶液中进行孵育，孵育结束后，用磷酸盐缓冲液清洗固定化酶纸片并弃去滤液，用体积百分比为50%的甲醇水溶液清洗固定化酶纸片并收集滤液，即筛选得到酶抑制剂；

所述待测样品溶液为诃子提取液；

所述固定化乙酰胆碱酯酶用量为1~5片，直径为1~ 12 mm；所述酶抑制剂模型溶液的用量为200~500μL；

所述孵育的具体条件为：25 ~ 50 ℃下孵育10 ~ 40min；

（3）将滤液注入超高效液相色谱-飞行时间质谱仪进行色谱分析及结构鉴定；总离子流图上出现阳性对照物的色谱峰说明实验有效，出现的其余色谱峰即为活性化合物，并根据飞行时间质谱得到的MS和MS/MS数据进行活性化合物的定性解析；

所述高效液相色谱-飞行时间质谱联用中各参数的设置条件为：

色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，3 mm × 150 mm，1.8 µm；柱温：35 ℃；流动相C：0.1 % 甲酸-乙腈和流动相D：0.1% 甲酸-水；流速0.250 mL/min；进样量：2µL；梯度程序：

0 ~ 5 min，流动相C由5%匀速变为15%，流动相D由95%匀速变为85%；

5 ~30 min，流动相C由15%匀速变为35%，流动相D由85%匀速变为65%；

30~ 32 min，流动相C由35%匀速变为5%，流动相D由65%匀速变为95%；

质谱条件：质谱型号：Agilent Q-TOF 6545飞行时间质谱；离子源：电喷雾离子源ESI；检测模式：负离子模式；扫描范围：m/z 50 ~1500；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：12.0L/min；鞘气流量：10.0 L/min；雾化气压力：40 psi；毛细管电压：3500V；碰撞电压：135V；母离子的 MS/MS 优化碰撞能：10 ~ 60 eV。