[发明专利]一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。该引物对包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物；探针序列如SEQ ID NO.3所示。本申请根据猪圆环病毒4型ORFs保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，优化实时荧光定量PCR反应条件和体系，建立了能够特异性检测PCV4的荧光定量PCR方法，最低检测值仅为20拷贝目的DNA，灵敏度高；并且，采用本申请方法检测不同稀释度PCV4标准品的Ct值变异系数均小于1％，表明本申请方法具有很好的重复性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种小型单股环状无囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径仅17～20nm。PCV已逐渐成为危害全球养猪业健康发展的又一主要致病病原，给世界养猪业带来巨大经济损失。目前猪圆环病毒可分为4个基因型，PCV1对猪无致病性，PCV2在临床上主要引起仔猪多系统衰竭综合症、肺炎、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)及繁殖障碍，可导致机体免疫抑制。PCV4于2016年首次报道，并证实PDNS、繁殖障碍以及流产等症状可能与PCV4感染有关。PCV4是最新发现的一种圆环病毒，2019年被报道在我国湖南患有严重呼吸道疾病、腹泻以及PDNS的猪只中发现，基因组大小为1770个核苷酸，与PCV其他型基因组的同源性仅为43.2％～51.5％，与水貂圆环病毒基因组同源性最高(66.9％)。PCV4是一种新型猪圆环病毒，与其他圆环病毒亲缘关系较远，目前关于PCV4的研究报道较少，现仍未成功分离到PCV4，因此，建立PCV4的快速检测方法对于开展该病毒的致病性、流行情况及遗传多样性研究具有重要意义。

现在普遍应用的常规PCR检测方法较为操作繁琐，耗时长，容易出现交叉污染及产生假阳性，对于隐性感染和混合感染的猪群病毒含量较低的情况，检出率低于实际感染率。而实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速高效等优点，其中分为染料法与探针法，染料法存在引物二聚体以及特异性差等问题，探针法既克服了常规PCR技术只能定性检测的不足，又解决了染料法特异性不强等缺点，更加适用于临床检测。

申请人兆丰华生物科技有限公司于2020年10月26日提出了发明专利申请CN202011156736.X，公开了检测PCV4的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用。该方法引物组由1对外引物和1对内引物组成，对于反应结果的判定需要眼观，无法准确定量检测，并且不能进行多重检测。

申请人咸阳职业技术学院于2020年01月06日提出了发明专利申请CN202010008953.8，公开了一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法。该发明采用的是常规PCR方法，存在敏感度低等技术缺陷，尽管最低检出值为10拷贝数，但与实时荧光定量PCR相比，反应时间长，不能满足临床上快速确诊相应疾病的需要。

基于此，亟需开发一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、设计盒及其检测方法，以快速特异地对PCV4进行检测。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法，本申请通过设计针对PCV4 ORFs的特异性引物，探索引物和探针最佳工作浓度，进一步确定最适反应体系及扩增条件，应用荧光定量PCR技术建立了定量检测PCV4的方法，该方法特异性强、重复性好、灵敏度高，为PCV4临床鉴别诊断提供了有力的技术支持。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于检测猪圆环病毒4型的引物对，包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物。

进一步地，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对用于扩增猪圆环病毒4型的高度保守区域。