[发明专利]基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法

权利要求书

1.基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法，其特征在于，制备固态纳米孔并活化，将带有羧基末端的硅烷固定在所述固态纳米孔表面，再与末端带氨基的适配体DNA反应，制得复合固态纳米孔，使用所述复合固态纳米孔检测与适配体DNA结合的C反应蛋白的过孔信号，测得其含量；所述方法包括如下步骤：

1）固态纳米孔的活化

去除固态纳米孔表面的杂质后用食人鱼洗液进行浸泡，再清洗制得活化后的固态纳米孔；

2）末端带羧基的硅烷分子的固定

氮气条件下，将步骤1）制得的所述活化后的固态纳米孔与酸性末端带羧基的硅烷试剂水溶液进行反应制得固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔；

3）CRP的适配体DNA的固定

将步骤2）制得的所述固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔经EDC/NHS活化后浸泡在含0.1～1μM末端带氨基的适配体DNA、pH5.5的0.1M MES溶液中反应，制得所述复合固态纳米孔；

4）在步骤3）所得所述复合固态纳米孔的膜片钳上外加偏压，在电解质溶液中检测C反应蛋白的含量；所述偏压强度为200～400mV。

2.根据权利要求1所述的C反应蛋白检测方法，其特征在于，在步骤1）前进行固态纳米孔的制备：在硅基氮化硅膜上制出直径为15～28 nm的孔道。

3.根据权利要求1所述的C反应蛋白检测方法，其特征在于，所述固态纳米孔的制备采用介电质击穿的方式，使用的电导液为1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA、pH8。

4.根据权利要求2所述的C反应蛋白检测方法，其特征在于，步骤1）中去除固态纳米孔表面的杂质步骤为：用加热的去离子水浸泡5～10分钟，去除无机杂质；用体积比丙酮：异丙醇：去离子水=1: 1: 1的混合溶剂浸泡去除有机杂质。

5.根据权利要求2所述的C反应蛋白检测方法，其特征在于，步骤1）中所述浸泡的温度为60±5℃；浸泡的时间为0.5～1小时。

6.根据权利要求2所述的C反应蛋白检测方法，其特征在于，步骤2）中所述酸性末端带羧基的硅烷试剂水溶液由等体积的末端带羧基的硅烷试剂、有机酸和水介质反应制得。

7.根据权利要求2所述的C反应蛋白检测方法，其特征在于，步骤4）所述电解质溶液为1M KCl、2mM CaCl₂、10mM Tris、pH 7.4。