[发明专利]结核分枝杆菌异质性耐药检测方法、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，本发明涉及结核分枝杆菌异质性耐药检测方法、试剂盒及应用。本发明提供了一种结核分枝杆菌异质性耐药检测方法，该方法包括分别利用引物混合物1和引物混合物2对核分枝杆菌的DNA进行多重PCR扩增，获得多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；本发明还提供了一种试剂盒及检测方法或试剂盒在检测结核分枝杆菌异质性耐药中的应用。利用该方法或试剂盒可有效检测出结核分枝杆菌突变频率不低于0.01％的突变；该方法的假阳性率低，约为0.01％；该方法的灵敏度高，当样本DNA浓度为1ng/ul时，可以有效检出0.1％的低频突变，适用于临床少量样本的检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及结核分枝杆菌异质性耐药检测方法、试剂盒及应用。

背景介绍

结核病人中同时存在敏感菌和耐药菌的现象称为异质性耐药。异质性耐药产生的原因包括两种，第一种是混合感染，并且感染的两种菌株分别为耐药结核分枝杆菌和敏感结核分枝杆菌；第二种是耐药克隆微进化的中间过程。由于结核分枝杆菌的自发突变，群体中会产生一些对抗生素耐药的克隆，这些克隆在抗生素的筛选下比例逐渐上升，在耐药克隆还未完全占据整个群体之前，群体中同时存在耐药克隆和敏感克隆，造成异质性耐药。

异质性耐药病人面临难以制定有效治疗方案的情况，对于群体中的耐药菌而言，如果继续使用已经耐药的药物，虽然可以清除敏感菌，但也会进一步筛选出耐药菌，进而削弱治疗方案的有效性。具体来讲，由于临床中没有对异质性耐药进行专门检测，往往按照敏感菌株的治疗方案进行治疗。在这样的治疗方案下，群体中耐药菌受到持续的筛选从而发展成为完全耐药，从而使治疗方案失效或者部分失效。另外一种情况是，如果使用新的药物清除耐药菌，可能导致敏感菌的比例上升。由于耐药突变的产生使得耐药菌的适应性低于敏感菌，当病人的依从性差或者使用效果较差的二线药物时，敏感菌株更强的适应力使得其比例反而上升。

现有的结核分枝杆菌药敏检测主要分为表型检测和基因型检测。传统的表型检测能够检测比例在1％以上的异质性耐药，然而其检测周期过长，由于结核分枝杆菌生长缓慢，即使采用液体培养依然需要3-7周的时间。现有的分子检测方法包括基于荧光探针检测的GeneXpert，线性探针杂交的Genotype MTBDR plus，Sanger测序等。GeneXpert对于结核病的快速诊断有划时代的意义，然而Robert的研究发现GeneXpert对于异质性耐药的检测灵敏性很低，只有当耐药菌在群体中的比例在65％-100％时才能成功的检测出突变。Genotype MTBDR试剂盒同样存在类似的缺陷，只能检测特定的突变，当异质性耐药中耐药菌株比例低于5％时也不能检出。而Sanger测序也只有当耐药菌的比例超过10％才能检测成功。

现有的分子药敏检测的方法对于异质性耐药的检测灵敏度较低，而表型药敏的方法检测周期也较长。这使得我们对异质性耐药的全面评估面临困难。随着全基因组测序(WGS)技术的发展，测序价格逐步降低，越来越多的研究都利用WGS来鉴定菌株的耐药性。由于WGS可以获得最完整的遗传信息，理论上所有的耐药突变都可以检测出来。但是由于建库中的PCR错误以及测序错误等背景噪音的影响，基于标准的WGS的方法对于异质性耐药的检测极限只能达到2％，即只有样本中耐药菌的比例在2％以上时，WGS才能检测成功。

对于比例低于1％的耐药突变(本文中称为低频耐药突变)，目前无有效的方法进行分析。造成这种状况的原因除了因为现有的检测方法不能达到1％以下的检测灵敏度外，另外一个原因是人为忽略了1％以下的异质性耐药，上世纪60年代的研究人员认为当群体中超过1％的细菌为耐药菌时才具有临床意义，因此设定1％为比例法的检测阈值。由于结核分枝杆菌在不同药物下的突变速率为10^-6至10^-9之间，因此当群体中有0.1％-1％比例(远远高于结核分枝杆菌耐药突变自发产生速率)的突变时已经表明这些耐药细菌是经过药物筛选产生的。目前，对于群体中有0.1％-1％比例突变的耐药细菌不能进行有效鉴定。

发明内容