[发明专利]一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与应用。首先通过RT‑PCR技术获得IBDV的VP2基因片段，然后以pBR322‑mFDHN3载体为模板，用特定引物通过PCR扩增得到F1和F2基因片段，再用SmaI酶切pBR322‑mFDHN3载体得到F4基因片段；将VP2基因片段与F1、F2和F4基因片段进行同源重组，得到重组质粒，最后将重组质粒转染BHK‑21细胞，得到重组病毒。本发明载体选用的是基因VII型NDV致弱病毒，是优质的NDV疫苗候选株，且能够表达IBDVvp2蛋白，可应用于制备NDV/IBD二联活毒疫苗。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与应用。

背景技术

传染性法氏囊病(IBD)，是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种高度传染性疾病。该病通过口-粪便途径传播，受感染的禽类在感染后约2周内会排泄高水平的病毒。因此该疾病很容易通过食物，水和身体接触从受感染的鸡只传播到健康的鸡群。IBDV主要感染法氏囊发育期的前B淋巴细胞并在其复制，导致B细胞死亡免疫功能抑制。其结果可造成疫苗接种失败，继发多种感染甚至死亡。近年来，在欧洲，拉丁美洲，东南亚，非洲和中东都出现了导致鸡严重死亡的极强毒型IBDV株(vvIBDV)，对全球家禽业已构成巨大威胁。

目前对该病毒的控制主要通过接种下面几种疫苗来进行。1.灭活苗：用得较多的IBD疫苗是油包水乳液灭活苗。灭活的IBD疫苗能够诱导IBDV特异性T细胞和炎症反应。但据报道灭活的IBD疫苗必须具有较高和优化的抗原含量才能诱导种鸡的免疫力和提供后代对IBDV变异株侵染的免疫保护。通常需要用减毒的活IBDV进行初免，然后追加灭活疫苗才能达到最佳的免疫效果。2.亚单位疫苗：IBD病毒的结构蛋白VP2是一种主要的保护性抗原蛋白，携带中和性抗原决定簇。该抗原决定簇是构象依赖性的，是有效的亚单位疫苗候选者。迄今为止，VP2蛋白已在杆状病毒，大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母表达系统中成功表达。由此所制的亚单位疫苗VP2已在一些国家销售。亚单位疫苗与灭活苗联合使用已初步显示出良好的效果，能提供100％受免鸡只对攻毒实验的保护。但灭活苗制作工艺复杂生产成本高。因为IBDV抗原决定簇是构象依赖性的，亚单位蛋白必须维持原病毒蛋白的空间构象才能保证抗原蛋白的免疫保护效力，因此IBDV抗原蛋白多采用在真核细胞里表达，这将大大增加疫苗的生产成本。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法。本发明方法将IBDV强毒株的VP2蛋白编码基因插到基因VII型新城疫(NDV)致弱重组病毒mFDHN3的P基因和M基因之间获得能有效表达IBDV vp2蛋白的感染性克隆质粒。将此质粒与辅助质粒合并转染BHK-21细胞能拯救出表达IBDV vp2蛋白的重组病毒。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的重组病毒。

本发明的再一目的在于提供上述重组病毒在制备NDV/IBD二联活毒疫苗中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)提取IBDV的总RNA，通过RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段；

(2)以pBR322-mFDHN3载体为模板，分别用引物mFDHN3-F1/mFDHN3-SmaI-R1和mFDHN3-SmaI-F2/mFDHN3-R2通过PCR扩增得到F1和F2基因片段；

(3)用SmaI酶切pBR322-mFDHN3载体，得到F4基因片段；

(4)将VP2基因片段与F1、F2和F4基因片段进行同源重组，得到重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2；