[发明专利]一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与应用

权利要求书

1.一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：

(1)提取IBDV的总RNA，通过RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段；

(2)以pBR322-mFDHN3载体为模板，分别用引物mFDHN3-F1/mFDHN3-SmaI-R1和mFDHN3-SmaI-F2/mFDHN3-R2通过PCR扩增得到F1和F2基因片段；

(3)用SmaI酶切pBR322-mFDHN3载体，得到F4基因片段；

(4)将VP2基因片段与F1、F2和F4基因片段进行同源重组，得到重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2；

(5)将重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2转染BHK-21细胞，得到表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒mFDHN3-VP2；

各引物序列分别如下：

mFDHN3-F1：

5’-CTACCCGTATTTTTTCTTAAGGTGTTGAAGCATGGATTCGC-3’；

mFDHN3-SmaI-R1：

5’-CAGCCACACGACCCCATCCACCCGGGACAACACAGGCACAGC-3’；

mFDHN3-SmaI-F2：

5’-CTTGGTGTTGCTTGAACTCACCCGGGTGACACGACTGCGAGATATGTTG-3’；

mFDHN3-R2：

5’-CCAGACAACAGCCCTCTCTC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中通过RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段的方法具体为：

1)将模板RNA与RT引物及去RNA酶水混合，得到模板RNA/引物混合液；

2)将模板RNA/引物混合液与缓冲液、dNTP、RNase抑制剂和反转录酶的混合液进行反应，得到RT产物；

3)以RT产物为模板，用引物VP2-F/VP2-R进行PCR扩增，得到VP2基因片段；

各引物序列分别如下：

VP2-F：5’-TTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGACAAACCTGCAAGATC-3’；

VP2-R：5’-GAGAGAGGGCTGTTGTCTGGAATTCTTACCTTATGGCCCGGATTATG-3’；

所述VP2基因片段的长度为1356bp，其序列见SEQ ID NO:15。

3.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述RT引物为随机引物或IBDV特异性引物。

4.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述pBR322-mFDHN3载体通过如下方法制备得到：

步骤1：将质粒pBR322-DHN3采用SmaI酶切，得到酶切后的质粒；

步骤2：采用引物change-F1-F、change-F1-R和change-F2-F、change-F2-R，以质粒pBR322-DHN3为模板扩增目的片段，得到PCR扩增产物；

步骤3：将酶切后的质粒和PCR扩增产物在重组酶的作用下同源重组，获得pBR322-mFDHN3载体质粒；

各引物序列分别如下：

change-F1-F：

CACCCCCAGCCACACGACCCCATCCACCCGGGACAACACAGGCACAGCTCGGCCAG；

change-F1-R：

CTATAAGGCGCCCCTGTCTCCCTCCTCCGGACGTGGATACAGACCCTTG；

change-F2-F：

GAGGGAGACAGGGGCGCCTTATAGGTGCTGTTATTGGCAGTGTAGC；

change-F2-R：

CTTGGTGTTGCTTGAACTCACCCGGGTGACACGACTGCGAGATATGTTG；

其中，质粒pBR322-DHN3为人工重组得到的DHN3全基因组表达质粒。