[发明专利]一种制备丝氨酸蛋白酶的方法

说明书

本发明涉及共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体以及宿主细胞。本发明还涉及利用所述表达载体或宿主细胞制备丝氨酸蛋白酶的方法。本发明共表达丝氨酸蛋白酶和相应的丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过由丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制过量表达的丝氨酸蛋白酶的部分活性，减少丝氨酸蛋白酶对表达细胞株造成的细胞毒性，提高表达细胞株对同等表达量的丝氨酸蛋白酶的耐受性。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种制备丝氨酸蛋白酶的方法。

背景技术

丝氨酸蛋白酶(或称丝氨酸内肽酶)是一种能在蛋白质中裂解肽键的酶，其中丝氨酸作为酶活性部位的亲核氨基酸。它们普遍存在于真核生物和原核生物中。丝氨酸蛋白酶根据其结构可分为两大类：类胰蛋白酶(类糜蛋白酶)或类枯草杆菌蛋白酶。其中胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在带正电的氨基酸(赖氨酸或精氨酸)后裂解肽键。这种特异性是由位于酶的底物结合口袋底部的残基(通常是带负电的天冬氨酸或谷氨酸)决定的。

胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶对维持生物体的内环境稳定起着重要作用，如控制血液凝聚、血纤蛋白溶解、激酶-激肽释放酶和补体系统。正常情况下，人体自身的内源性蛋白酶抑制剂能保护保护蛋白酶所致的潜在的破坏作用，若蛋白酶抑制剂浓度下降，则破坏了蛋白酶和抗蛋白酶之间的平衡。过量蛋白酶的活化会导致各种疾病的发展，如胰腺炎或弥散性血管内凝血疾病等。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶能使各种疾病激活，而其抑制剂通常是治疗或预防血栓形成、炎症疾病、自身免疫及相关疾病的有效药物。

生物工程中常用哺乳动物细胞表达重组蛋白，而某些用于临床治疗的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(如各类凝血因子和溶栓酶等)常存在哺乳动物细胞内表达量低的问题，进而增加药物的生产成本。其原因在于过量表达的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性会引起细胞毒性。即使是表达活性较低或无活性的蛋白酶前体，也可能在表达过程中有部分或少量被提前激活，细胞毒性超过一定限度时，会对表达胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的细胞群体造成一定的筛选压力，导致最终筛选得到的细胞株几乎都是低表达的。即使偶有高表达细胞株，也无法长期稳定存在，难以用于大规模商业化生产。

发明内容

第一方面，本发明提供共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体。

在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，或可称为类胰蛋白酶。

在一些实施方式中，所述表达载体为组成型表达载体。优选地，所述表达载体的表达无需诱导剂的诱导。本发明采用组成型表达载体共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以无需诱导而实现目标蛋白的组成型表达，从而避免了额外添加诱导剂导致的细胞生长或代谢抑制，进而影响蛋白的翻译后修饰。且本发明提供的表达载体安全性高，更利于目标蛋白后续的纯化继而作为药物使用。

在一些实施方式中，所述表达载体为pXC17.4载体、pXC18.4载体或pXC17.4和pXC18.4的连接载体。

在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶为组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogen activator,tPA)。

在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种。

在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。

在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。