[发明专利]一种制备丝氨酸蛋白酶的方法

权利要求书

1.共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶；

优选地，所述表达载体为组成型表达载体；

更优选地，所述表达载体的表达无需诱导剂的诱导。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为组织型纤溶酶原激活剂；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。

更优选地，所述α-抗胰蛋白酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；和/或，所述牛胰蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和/或，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；和/或，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-2具有如SEQID NO:5所示的氨基酸序列；和/或，所述纤溶酶原激活剂抑制剂-3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；和/或，所述神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或，所述胶质细胞源性连接蛋白具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的表达载体，其特征在于，所述共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体采用包括如下步骤的方法制备得到：将插入编码所述丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的表达载体和插入编码所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列的表达载体，连接成双表达框表达载体；

优选地，所述共表达丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达载体采用包括如下步骤的方法制备得到：将编码所述tPA的核苷酸序列插入pXC17.4表达载体中，得到pXC17.4-tPA；将编码所述SPI的核苷酸序列插入pXC18.4表达载体，得到pXC18.4-SPI；所述将pXC17.4-tPA和pXC18.4-SPI用NotI和PvuI进行酶切，连接成同时表达tPA和SPI的双表达框表达载体pXC-tPA-SPI。

5.外源转入了权利要求1～4任意一项所述表达载体的宿主细胞；

优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为来自大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、猴或人的细胞；

更优选地，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞，优选为CHO K1细胞。

6.丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂形成的非共价复合物，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，优选所述非共价复合物的形成可逆；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶为组织型纤溶酶原激活剂。

7.根据权利要求6所述的非共价复合物，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种。