[发明专利]一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体：AAV载体中包含CasRx蛋白表达、U6启动子驱动sgRNA表达。一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体的构建方法：当从生产细胞的条件培养基中分离AAV载体时，AAV可以与外泌体exoAAV结合，利用外泌体包裹AAV载体可以实现基因载体的高效递送。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1.基因敲出效率更高(＞90％)；2.与RNA干扰(shRNA)相比，消除了脱靶效应；3.具有靶向核RNA(包括非编码RNA)的能力；4.操纵拼接，包括纠正错接缺陷和有针对性的外显子跳跃；5.体积小，可实现单载体AAV‑CasRx并在体内引导RNA。

技术领域

本发明涉及基因技术领域，具体为一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体及其构建方法和应用。

背景技术

2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家HiroshiNishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”

此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆(FTD)患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80％。

基因沉默也叫基因沉寂，是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。指的是真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除细胞非正常RNA的一种机制。以前，“基因沉寂”被理解为是真核生物染色体形成异染色质(Heterochromatin)的过程。最近的研究表明，“基因沉寂”与“异染色质”存在差异，尽管被沉寂的基因区段也呈高浓缩状态，但“基因沉寂”所形成的染色体构象并不完全等同于异染色质“构象。除此之外，两者还存在着基因表达调控程度上的差异，一般认为处于基因沉寂“的染色质区的基因表达被”彻底“关闭，而”异染色质“状态的基因可能依然进行低水平的表达(转录)。

CRISPR/Cas13系统是继CRISPR/Cas9之后最新发现的一类核酸酶切割系统，与Cas9靶向基因组DNA不同，Cas13是通过特异靶向RNA，实现对RNA定点剪切、定点编辑。目前已发现LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx(RfxCas13d)等多个Cas13核酸酶家簇，这些都具有靶向切割RNA的功能，其中生黄胃球菌来源的一种CasRx(RfxCas13d)在特异性和切割效率是最优的核酸酶，也是目前发现最小的VI型CRISPR-Cas系统效应蛋白，由于DNA编码序列2.8kb左右，而AAV载体的总包装容量是4.7kb,因此我们能利用AAV载体包装RfxCas13d。Cas13d酶很小，平均大小为930个氨基酸，可将CasRx蛋白融合编码多个的基因靶点的配对的指导sgRNA，同时保持在AAV包装尺寸范围内。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体及其构建方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体：AAV载体中包含CasRx蛋白表达、U6启动子驱动sgRNA表达。

一种如上所述的外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体的构建方法：当从生产细胞的条件培养基中分离AAV载体时，AAV可以与外泌体exoAAV结合，利用外泌体包裹AAV载体可以实现基因载体的高效递送。