[发明专利]一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体，其特征在于：AAV载体中包含CasRx蛋白表达、U6启动子驱动sgRNA表达。

2.一种如权利要求1所述的外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体的构建方法，其特征在于：当从生产细胞的条件培养基中分离AAV载体时，AAV可以与外泌体exoAAV结合，利用外泌体包裹AAV载体可以实现基因载体的高效递送。

3.一种如权利要求1所述的外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：Expi293F^TM细胞培养至4×10⁶活细胞/mL；

步骤二：100mL细胞，准备80μg质粒，用5mLOpti-MEM培养基稀释质粒，质粒用量好下，pAAV-CasRX-U6-gRNA:20ug,pAAV-RC:20ug,phepler：40ug混匀后静置5分钟；

步骤三：每100mL细胞需要准备160μLPEI试剂，用5mLOpti-MEM培养基稀释，混匀后静置5分钟；

步骤四：将步骤三、四中的试剂混匀静置15分钟；

步骤五：将试剂加入细胞中，混匀，放置于培养箱内进行培养；

步骤六：48h-72h后收集外泌体；

步骤七：Expi293转染后表达第3天和第6天通过离心收集培养基，通过差速离心从收集的培养基中纯化表达的外泌体，将收获的含有外泌体的细胞培养物在4℃条件下以100×g离心10min后再用4000×g离心30min，将其离心后的上清液转移至新的离心管中以20000×g，离心60min，转移其上清以200000×g离心120分钟，倒出上清液，最后将外泌体用500ulPBS洗涤两次，使用Nanosight通过NTA测定纯化的外泌体的颗粒浓度和大小分布。

4.根据权利要求3所述的一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体的应用，其特征在于：所述用于培养悬浮细胞的容器采用聚碳酸酯或PETG材质、无挡板、一次性无菌透气平底无菌锥形瓶。

5.根据权利要求3所述的一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体的应用，其特征在于：所述细胞摇床条件为，置于≥80％相对湿度和8％CO2的37℃培养箱，速度为80rmp。