[发明专利]一种基于荧光RMA法多重检测人副流感病毒亚型的引物探针组、试剂盒及其检测方法

说明书

本申请属于人副流感病毒亚型的检测方法，具体为一种基于荧光RMA法多重检测人副流感病毒亚型的引物探针组、试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水；所述扩增反应试剂包括HPIV1‑3的引物和探针、M‑MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；所述标准阳性质粒为HPIV1的HN基因片段与pMD18‑T载体相连接后得到的重组质粒。

技术领域

本申请属于人副流感病毒亚型的检测方法，具体为一种基于荧光RMA法多重检测人副流感病毒亚型的引物探针组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

人副流感病毒(HPIV)是一种常见的易被忽略的呼吸道感染病原体，主要引起婴幼儿、儿童及免疫抑制人群严重的呼吸道感染。在成人患者中，副流感病毒感染也可以导致一系列呼吸道疾病，包括上呼吸道感染、慢性疾病的急性加重、肺炎等，临床表现多样，病原学表现与其他常见呼吸道感染表现相似。此外，缺乏血清学的保护，也促使了副流感病毒的反复感染。人副流感病毒(HPIV)是一类具有多形性、有包膜的单股负链RNA病毒，属副黏病毒科，分为4种亚型(HPIV1-4)。4种亚型中，除了HPIV4仅引起轻微的呼吸道疾病，分离和流行病学很少有报道外，1、2、3型引起呼吸道疾病的报道都比较常见。其中：1型和2型最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，1型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，2型次之；3型是仅次于呼吸道合胞病毒的婴儿支气管炎和肺炎的病原体，常引起婴幼儿急性呼吸道感染。早期快速诊断副流感病毒感染能够及时指导临床治疗为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据并在防止抗生素滥用方面具有重要意义。

目前检测副流感病毒的方法较多，但都存在不足，如病毒分离培养法耗时极长且假阴性较多，不能作为副流感病毒快速诊断的方法；直接免疫荧光检测法检测速度快，但敏感性不如组织培养，结果判定需要丰富经验；酶联免疫法检测的是病毒特异性抗体但一次仅能检测一种病毒；荧光定量PCR法操作程序复杂、需要精密的仪器、检测时间较长，不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。

重组酶介导扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA反应最适温度在37～42℃，整个过程在10-30min内即可完成，30min内就可以将靶序列扩增到10～12数量级，可实现核酸的快速检测。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法多重检测人副流感病毒亚型的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种荧光RMA法多重检测人副流感病毒亚型的引物探针组，所述引物探针组为根据HPIV特异性基因序列HN设计的引物和探针，

HPIV1引物和探针序列为：

HPIV1-F：

5’-TGTTCTGTAATAGCTGCAGGAACAAGGGGTTACCA-3’；

HPIV1-R：

5’-ACATTTGCTTATCACACACTTGGTGTTGCCTTGGA-3’；

HPIV1-P：

5’-ATGCTCCTTGCCCACTGTGAATGAGACTACAGA(FAM-dT)(THF)AC(BHQ-dT)CGAGTGAAGGTATAGA(C3-spacer)-3’。

HPIV2引物和探针序列为：

HPIV2-F：