[发明专利]一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用

说明书

本发明的目的之一是提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let‑7基因的shRNA、siRNA、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。本发明使用敲降或敲除一个microRNA—let‑7b的表达而不引入任何外源基因，由成纤维胞成功诱导出神经干细胞，可在短时间内扩增产生能够足够移植所需的细胞量，并且是遗传稳定的，能分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可扩增超过20代以上的神经干细胞，移植给老鼠也未见诱导肿瘤形成。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用。

背景技术

干细胞技术的发展为许多神经系统疾病治疗带来了希望，包括神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森氏病等，神经损伤性疾病如脊髓损伤，还有肌萎缩性脊髓侧索硬化症、自闭症等。研究表明，使用胚胎干细胞分化形成的神经元治疗阿尔茨海默症、帕金森、脊髓损伤等疾病有一定作用，但胚胎干细胞的来源存在伦理争议，还有致瘤性和免疫排斥作用限制了其应用。

由体细胞重编程形成的诱导多能干细胞(iPSCs)，可以解决免疫原性，但面临潜在致瘤性，定向分化效率低等问题。神经干细胞(NSCs)是指一类具有自我复制和自我更新能力，且能高度增殖和进行多向分化的细胞，在研究神经系统发育、分化以及治疗神经系统疾病中具有重要的作用。因此，将体细胞直接重编程为诱导神经干细胞(induced neuralstem cells，iNSCs)，而不经过iPSCs阶段，从而减少其致瘤性、提高分化效率，成为现在干细胞研究领域中的研究热点。

一些研究学者利用几个转录因子进行组合重编程鼠的成纤维细胞诱导生成稳定可扩增的神经干细胞。这些研究对于重编程干细胞形成神经干细胞的策略是可以借鉴的，Thier等利用传统的多能干细胞重编程因子(sox2、oct4等)在最初的重编程过程中限制了OCT4的表达，产生的神经干细胞聚集的神经克隆球能够无限扩增至50代而不改变分子性能，同时这些神经干细胞也能够表达神经细胞特定的表面标志如Nestin和Olig2等。Han等同样用了转录因子的组合(Brn4/Pou3f4,Sox2,Klf4,c-Myc,和E47/Tcf3)直接重编程鼠的成纤维细胞诱导生成神经干细胞，产生的神经干细胞注射到免疫小鼠脑内没有产生畸胎瘤，并且这种细胞具有脑源性神经细胞的分子学特征、分化性能和自我更新的能力。此外体内分化中能够产生神经元体系，而且只有一小部分移植细胞维持神经祖细胞的性能。裴端卿等使用非整合质粒载体携带Oct4,Sox2,Sv40LT,Klf4和microRNA302-367电转入人尿液中提取的活细胞，诱导形成神经干细胞，电转后12天可见神经干细胞克隆出现，但是不能自然分化为少突胶质细胞。总体上，从体细胞转染转录因子诱导神经干细胞，需要较长时间的培养，才能形成神经干细胞克隆，诱导效率也较低。

由此可见，现有技术中采用外源基因进行重编程神经干细胞诱导的成功率较低，且病毒转染时可能将外源基因整合到细胞基因组中，导致供体细胞基因突变；此外，诱导得到的神经干细胞体外扩增代数少，体细胞重编程的周期长、重编程效率低，数量上无法满足临床需求，而不适用于脑中风损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病，数量能够满足临床需求。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，并将获得的神经干细胞应用于植被预防和治疗神经系统疾病的药物组合物。

本发明要解决的技术问题主要在于克服现有技术中重编程体细胞转化效率较低、神经干细胞克隆形成效率低和体细胞转分化的周期长等缺陷，从而提供一种可以利用自身体细胞快速重编程、转分化效率高、转分化时间短的神经干细胞的诱导方法。

与此同时，由于现有的转分化重编程方法涉及到外源基因的介入，具有很大的临床安全隐患。因此，本领域迫切需要一种新的不需要外源基因介入的诱导体细胞转分化为神经干细胞将为神经干细胞的方法。