[发明专利]一种自然共生的混合培养物及其降解秸秆生产香豆酸酯酶的方法

说明书

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体涉及一种自然共生的由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成的混合培养物YakQH5，于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，所述的混合培养物YakQH5能够发酵秸秆生产香豆酸酯酶，并具体公开了其发酵方法，其中降解高粱秸秆产生的香豆酸酯酶的活性可达到20.5mU，在发酵过程中添加复合抗生素，可以防止混合培养物体系不受细菌污染，进一步提高厌氧发酵效率，具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种自然共生的由厌氧真菌和甲烷菌组成的自然混合培养物及其降解秸秆生产香豆酸酯酶的方法。

背景技术

农作物秸秆是农业废弃物面源污染的主要来源，且我国的农作物秸秆年产量高，常规的处理方法如露天焚烧、掩埋等，污染环境的同时还会造成大量的能源浪费。然而我国的大量秸秆资源处于高消耗、高污染、低利用率状况。木质纤维素是秸秆的主要成分，木质纤维素主要由纤维素、半纤维和木质素组成。木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，强的共价键抑制水解酶的作用，导致木质纤维素的降解很困难。常见的预处理木质纤维素的方法有机械法、热处理法、化学处理，均能有效的促进木质纤维素的分解，但这些处理方法成本高，不环保。普通的微生物处理也存在较多缺陷，单一微生物处理效果不好，人工构建的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致降解木质纤维素的时间长，效率低。

厌氧真菌在木质纤维素的降解中起重要作用。厌氧真菌通过丰富的菌根体系侵袭一些难以被降解的纤维组织，甚至是植物厚壁组织和维管束组织使植物纤维组织变得疏松从而易于被其它瘤胃微生物降解。厌氧真菌中的大多数种属都能够通过其假根分泌高活性酶，包括纤维素酶、半纤维素酶(主要是木聚糖酶)和酯酶(包括阿魏酸酯酶、乙酰酯酶和香豆酸酯酶)等多种酶，它们协同作用分解利用结构复杂的，晶体状的纤维素、半纤维素和果胶等物质。木质纤维素中的木质素和多糖通过酚酸交联在一起。以酚酸为主的木质素成分是植物细胞壁降解的限制性因素，酚酸中的阿魏酸和香豆酸被认为是细胞壁降解的限制因子。阿魏酸通过酯键与多糖相连，通过醚键与木质素相连，香豆酸即通过酯键也通过醚键与木质素相连，厌氧真菌产生的阿魏酸酯酶和香豆酸酯酶能够打开木质素、阿魏酸、香豆酸和细胞壁多糖交联的酯键结构，减少酯键交联，从而增加木质纤维素的降解。现有研究表明，一些甲烷菌可以利用厌氧真菌的代谢产物，如氢气、甲烷、甲酸等，与厌氧真菌形成稳定的混合培养物，即：厌氧真菌和甲烷菌混合培养物，这个过程促进了厌氧真菌和甲烷菌的生长，同时显著提高了厌氧真菌降解木质纤维素所产生的各种木质纤维素降解酶活性和对木质纤维素的降解能力。

牦牛适应高寒生态条件，耐粗饲、耐严寒、耐低氧的恶劣自然环境。牦牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同高效降解野牧草为牦牛提供生存能量和营养物质。漫长的自然选择和进化使牦牛瘤胃成为一个高效降解木质纤维素的天然厌氧发酵罐。放牧牦牛瘤胃内存在着自然的厌氧真菌和甲烷菌混合培养物，它们能够分泌高活性的多糖水解酶和酯酶降解大量野生牧草和冷季干枯牧草为牦牛提供生长的营养，因此从牦牛瘤胃分离厌氧真菌和甲烷菌混合培养物并将其应用于降解廉价木质纤维素底物生产高活性酯酶在工业应用方面具有重要意义。发明人在攻读博士期间首次研究了放牧牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌混合培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、各种酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解秸秆功效，其中高效降解以上三大秸秆的厌氧真菌和甲烷菌共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium，Piromyces Yak18+M.ruminantium和O.joyonii Yak7+M.ruminantium分别降解三大秸秆所产生的香豆酸酯酶活性都低于5.0mU，不能达到产生高酶活香豆酸酯酶的效果。