[发明专利]一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

本发明提供一种合成3‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法，所述重组大肠杆菌是通过在大肠杆菌的基因组中敲除β‑半乳糖苷酶基因、从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因，强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶基因得到的。本发明的方案能够降低乳糖水解，提高外源乳糖转移到细胞内的速率，从而有效提高细胞内乳糖浓度；同时，减少鸟苷二磷酸岩藻糖的消耗，有效提高细胞内鸟苷二磷酸岩藻糖浓度；通过密码子优化从而改善外源岩藻糖基转移酶基因的表达，有效地促进了3‑岩藻糖基乳糖的合成。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法。

背景技术

母乳是一种复杂的混合物，含有水、脂肪、蛋白质、矿物质、维生素、多糖、单糖、双糖(乳糖)、低聚糖。乳糖是母乳主要固体成分(总固形物的～6.8％)，同时广泛存在于动物乳汁。但是，结构较复杂的母乳低聚糖(总固形物的～1％)却是人类所独有的。目前，结构确证的母乳低聚糖大约有200种，聚合度从3到32不等。母乳低聚糖的结构特征包括乳糖-N-乙酰葡萄糖胺骨架、直链β-(1,3/4)-糖苷键、支链β-(1,6)-糖苷键、乳糖在糖链还原末端而L-岩藻糖或唾液酸在非还原末端。

3-岩藻糖基乳糖是哺乳期母亲乳汁中普遍存在并且含量较为丰富的母乳低聚糖。3-岩藻糖基乳糖占母乳低聚糖总量的比例可以高达5％。因此，3-岩藻糖基乳糖的研究较为充分，并且发现3-岩藻糖基乳糖具有多种有益功能。例如，3-岩藻糖基乳糖特异性地抑制致病性大肠杆菌、诺如病毒与对应宿主受体的结合从而避免感染。3-岩藻糖基乳糖可以抑制绿脓杆菌与局部上皮细胞的相互作用，从而避免绿脓杆菌对胃肠道、尿道和呼吸系统的感染。3-岩藻糖基乳糖还可以特异性地增殖肠道特定有益菌从而调节肠道菌群的结构与功能。此外，3-岩藻糖基乳糖通过上调肠道杯状细胞分泌相关基因的表达从而增强肠道黏液屏障功能。

3-岩藻糖基乳糖有益健康，并且，相关试验数据显示，符合食品安全法规要求，有望用作婴儿配方食品和医学营养产品的功能食品原料。然而，3-岩藻糖基乳糖的工业化生产并非易事。早期，3-岩藻糖基乳糖是从捐赠的母乳中色谱分离获得的，由于材料来源有限，无法大规模生产。3-岩藻糖基乳糖可以直接化学合成，然而，受限于保护基团的化学性质，无法扩大规模，并且化学合成需要使用有毒试剂，更不适于大规模食品生产。岩藻糖基转移酶可以体外催化合成3-岩藻糖基乳糖，但是，供体底物鸟苷二磷酸岩藻糖十分昂贵。因此，对于年产数百吨的工业生产，3-岩藻糖基乳糖的酶法合成并不适用。微生物发酵是目前唯一适合大规模生产的技术路线。代谢工程、发酵工程、纯化工艺等技术进展，使3-岩藻糖基乳糖的大规模生产逐步成为现实。在发酵过程中，供体底物分子鸟苷二磷酸岩藻糖由微生物自身从头合成，而受体底物分子乳糖一般由外部加入。

因此，构建一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，有效促进3-岩藻糖基乳糖的发酵合成，并为未来规模化生产奠定坚实基础是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法，克服了同源重组技术的试验周期较长、成功率较低等难题，优化外源岩藻糖基转移酶基因的表达，有效地促进了3-岩藻糖基乳糖的合成，从而实现3-岩藻糖基乳糖的高效发酵合成。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明的方案提供一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌原始菌株的基因组中敲除β-半乳糖苷酶基因、从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因，强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶基因得到的。

优选地，所述敲除β-半乳糖苷酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ，敲除从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除十一碳二烯磷酸酯葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ。