[发明专利]一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌原始菌株的基因组中敲除β-半乳糖苷酶基因、从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因，强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶基因得到的。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述敲除β-半乳糖苷酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ，敲除从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除十一碳二烯磷酸酯葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：利用CRISPR基因编辑技术敲除十一碳二烯磷酸酯葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ时，敲除基因wcaJ的gRNA1的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，敲除基因wcaJ的gRNA2的靶标序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：利用CRISPR基因编辑技术敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ时，敲除基因lacZ的gRNA1的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，敲除基因lacZ的gRNA2的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术在鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的磷酸甘露糖变位酶基因manB上游敲入T7lac启动子。

6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于：利用CRISPR基因编辑技术在鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的磷酸甘露糖变位酶基因manB上游敲入T7lac启动子时，敲入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，敲入位置上游基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，敲入位置下游基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌携带用于诱导高表达蛋白质的多个重组质粒，所述重组质粒分别包含基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manC、鸟苷二磷酸甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd、鸟苷二磷酸-L-岩藻糖合成酶基因fcl、乳糖通透酶基因lacY、外源岩藻糖基转移酶基因。

8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述外源岩藻糖基转移酶cafF基因源自嗜黏蛋白阿克曼氏菌，密码子优化的cafF基因序列如SEQ ID NO.14所示。

9.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：原始菌株为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

10.一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分别制备含有基因manB，基因manC，基因gmd，基因fcl，乳糖通透酶基因lacY，密码子优化的基因cafF的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；

2)检测显示大肠杆菌BL21(DE3)原始菌株生长状态正常，目标基因wcaJ和lacZ以及T7lac启动子敲入位置及其上下游序列的检测显示，PCR扩增条带大小符合预期，测序结果与NCBI序列一致；

3)根据目标基因序列的插入位置及周围的序列特点，设计并制备gRNA，将gRNA以及Donor序列克隆至基因编辑载体Donor质粒，并通过测序验证确保构建的载体中gRNA以及Donor序列均与目标序列一致；

4)制备大肠杆菌BL21(DE3)电转感受态，Cas9质粒转化至BL21(DE3)感受态中，挑斑制备BL21(DE3)-Cas9电转感受态，Donor质粒转化至BL21(DE3)-Cas9电转感受态，加入阿拉伯糖诱导后涂板，进行基因编辑菌株筛选实验；

5)PCR扩增验证编辑后的BL21(DE3)单克隆，wcaJ基因敲除成功条带大小771bp，未敲除成功条带大小为1049bp；lacZ基因敲除成功条带大小687bp，未敲除成功条带大小为983bp；T7lac启动子敲入成功的条带大小1076bp，未敲入成功无条带；电泳图显示，成功筛选到wcaJ基因和lacZ基因同时敲除并且T7lac启动子敲入的单克隆；

6)将步骤5)中CRISPR编辑的大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤1)所得的代谢途径构建质粒转化到溶源菌中，获得能够合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌。