[发明专利]一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法

权利要求书

1.一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法，包括下述步骤：

1)菌种复苏：将-80℃微生物接种到100ml的液体培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养，作为菌种基液；

2)将微生物菌种基液按照一定比例接入液体培养基中，摇床中避光培养；

3)在上述步骤2)的菌种基液中，加入0.5％-20％的糖类或者多元醇类物质的水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀；

4)将液体重悬沉淀移至离心管中，离心弃去上清液后，加入适量磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎；

5)将超声破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清液保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

6)将步骤5)得到的生物膜结构加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

7)取用上述红棕色固液体5ml，利用PBS溶液稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声破碎开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的药物溶液1.5ml；超声破碎后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。

2.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，步骤2)所选择的微生物为酵母菌、大肠杆菌、嗜热栖热菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤1)中摇床避光培养时间为12-60小时。

4.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，，其特征在于，所述的步骤2)中微生物菌种基液和培养基的容积比例为1：1-1：10。

5.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤2)中液体培养基的培养温度为20℃-110℃。

6.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤1)、2)中培养基类型为酵母浸膏-胰蛋白胨培养基。

7.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤3)中加入的多元醇或者糖类为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇中的一种。

8.根据权利要求1或6所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤3)中加入的糖类或者多元醇类物质的水溶液为培养液容积的0.5％-8％。

9.根据要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤4)、6)、7)中选择磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)的PH为5.6-7.8。

10.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤7)中所述药物溶液为丙酮溶剂、乙醇溶剂、甲醇溶剂中的一种。

11.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，其特征在于，所述的步骤7)中所述药物为姜黄素、顺铂、卡铂、伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱、阿霉素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、依托泊苷中的一种。