[发明专利]一种内皮细胞成骨诱导分化培养基及制备方法

权利要求书

1.一种内皮细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于：由以下组分制成，

α-MEM培养基、胎牛血清5-50％体积百分比、Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) 0.1%-5%体积百分比、bFGF 1-10ng／ml、EGF 1-10ng／ml、VEGF 5-50ng／ml、TGF-β 5-50ng／ml浓度、MSCGS 0.1%-5%体积百分比、丙酮酸钠 0.1-10mM、巯基乙醇0.01-1mM、Dexamethasone 10-200nM浓度、Vc 10-150ug／ml浓度、β-甘油磷酸钠1-100mM浓度、L-谷氨酰胺10-50mM浓度、青链霉素 0.1%-5%体积百分比。

2.根据权利要求1所述的一种内皮细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于：由以下组分制成，

α-MEM培养基、胎牛血清20％体积百分比、Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G)1%体积百分比、bFGF 5ng／ml、EGF 1ng／ml、VEGF 50ng／ml、TGF-β25ng／ml浓度、MSCGS 1%体积百分比、丙酮酸钠 0.5mM、巯基乙醇0.05mM、Dexamethasone 80nM浓度、Vc 70ug／ml浓度、β-甘油磷酸钠10mM浓度、L-谷氨酰胺20mM浓度、青链霉素 1%体积百分比。

3.根据权利要求1或2所述的一种内皮细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于，所述TGF-β为TGF-β2。

4.一种内皮细胞成骨诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、成分配置：

按照试剂要求配置VEGF 母液、 TGF-β母液 、丙酮酸钠母液，巯基乙醇母液，Dexamethasone母液 、Vc母液、β-甘油磷酸钠母液、L-谷氨酰胺母液、青链霉素母液，母液使用0.22μm滤膜过滤除菌；

步骤二、在超净台中按照发明配方配置皮肤微血管内皮细胞工作浓度培养液，α-MEM培养基、胎牛血清20％体积百分比、bFGF 5ng／ml，EGF 1ng／ml，VEGF 50ng／ml ，Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) 1%体积比、TGF-β25ng／ml浓度，MSCGS 1%体积比、丙酮酸钠 0.5mM，巯基乙醇0.05mM，Dexamethasone 80nM浓度，Vc 70ug／ml浓度，β-甘油磷酸钠10mM浓度、L-谷氨酰胺20mM浓度、青链霉素 1%体积百分比；

步骤三、预处理：

从液氮罐中复苏皮肤微血管内皮细胞，调整细胞状态，使其达到生长对数期，使用0.25%胰酶消化细胞，用内皮细胞成骨诱导分化培养液重悬细胞，使其浓度为1X10^6个/mL；

步骤四、分组培养，取步骤三细胞悬液100ul，即细胞量为1x10^5个细胞加至12孔板中，补加内皮细胞成骨诱导分化培养基900ul至12孔板中，放置条件为5%CO2，37摄氏度培养箱中培养；

步骤五、换液：每隔3天，去除12孔板中的培养液，加入新的内皮细胞成骨诱导培养液，后续每隔3天更换一次，21天结束，即可形成成骨细胞；

步骤六、检测。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述皮肤微血管内皮细胞选自表皮微血管内皮或真皮微血管内皮。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述TGF-β为TGF-β2。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括1％体积百分比的非必需氨基酸，或1％体积百分比的抗生素。