[发明专利]一种5-甲基四氢叶酸化学发光检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种5-甲基四氢叶酸化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；

所述第一试剂为5-甲基四氢叶酸-碱性磷酸酶连接物，其通过下述步骤制备得到：通过混合酸酐法制备的5-甲基四氢叶酸-碱性磷酸酶连接物作为第一试剂，将5-甲基四氢叶酸溶解于二甲基亚砜，然后分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化反应，取活化产物加入碱性磷酸酶室温反应得到所述5-甲基四氢叶酸-碱性磷酸酶连接物，将所述5-甲基四氢叶酸-碱性磷酸酶连接物加到0.02M、pH7.4的PBS缓冲液中；

所述第二试剂为抗5-甲基四氢叶酸抗体-羧基磁珠微粒子工作液，其通过下述步骤制备得到：用0.05M pH7.4的PBS缓冲液溶解抗5-甲基四氢叶酸抗体配制成抗5-甲基四氢叶酸抗体溶液，用EDC将羧基磁珠配制成羧基磁珠溶液；混合所述抗5-甲基四氢叶酸抗体溶液和所述羧基磁珠溶液，用0.05M pH7.4的PBS缓冲液进行封闭反应，反应完成后PBS缓冲液对羧基磁珠进行清洗，获得抗5-甲基四氢叶酸抗体-羧基磁珠，用Tris缓冲液将抗5-甲基四氢叶酸抗体-羧基磁珠配制成所述第二试剂；

所述第三试剂为pH 7 .5的清洗缓冲液；

所述第四试剂为酶促发光的底物液，其通过下述步骤制备得到：取一定量的金刚烷AMPPD底物液，采用0.02M、pH＝7.0的PBS缓冲液稀释用于作为酶促发光底物液；或者

所述第一试剂为5-甲基四氢叶酸-吖啶酯连接物，其通过下述步骤制备得到：将5-甲基四氢叶酸溶解于二甲基亚砜，吖啶酯用二甲基甲酰胺/二甲基亚砜溶解，将溶解好的吖啶酯加入溶解好的5-甲基四氢叶酸，加入终止反应液进行反应，得到所述5-甲基四氢叶酸-吖啶酯连接物，将所述5-甲基四氢叶酸-吖啶酯连接物加到0.02M、pH7.4的PBS缓冲液中；

所述第二试剂为抗5-甲基四氢叶酸抗体-羧基磁珠微粒子工作液，其通过下述步骤制备得到：用0.05M pH7.4的PBS缓冲液溶解抗5-甲基四氢叶酸抗体配制成抗5-甲基四氢叶酸抗体溶液，用EDC将羧基磁珠配制成羧基磁珠溶液；混合所述抗5-甲基四氢叶酸抗体溶液和所述羧基磁珠溶液，用0.05M pH7.4的PBS缓冲液进行封闭反应，反应完成后PBS缓冲液对羧基磁珠进行清洗，获得抗5-甲基四氢叶酸抗体-羧基磁珠，用Tris缓冲液将抗5-甲基四氢叶酸抗体-羧基磁珠配制成所述第二试剂；

所述第三试剂为pH 7.5的清洗缓冲液；

所述第四试剂为直接发光底物液，其通过下述步骤制备得到：用0.01mol/L pH7.5的Tris-HCl溶液配制含有浓度为0.01 mol/L的双氧水和浓度为0.2mol/L的硝酸溶液配制成底物液A；用0.01mol/L pH7.5的Tris-HCl溶液配制含有浓度为0.1g/L的氢氧化钠溶液配制成底物液B。

2.根据权利要求1所述的5-甲基四氢叶酸化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂为抗5-甲基四氢叶酸抗体-Tosyl磁珠工作液，其制备步骤包括：

S21、将抗5-甲基四氢叶酸抗体和Tosyl磁珠分别溶解于硼酸盐缓冲液中，获得5-甲基四氢叶酸抗体溶液和Tosyl磁珠溶液，用于抗5-甲基四氢叶酸抗体稀释的缓冲液为0.1M、pH9 .5的硼酸盐缓冲液；

S22、混合所述5-甲基四氢叶酸抗体溶液和所述Tosyl磁珠溶液，用硼酸盐缓冲液进行封闭反应，反应完成后用PBS缓冲液对Tosyl磁珠进行清洗，获得抗5-甲基四氢叶酸抗体-Tosyl磁珠，用Tris缓冲液将抗5-甲基四氢叶酸抗体-Tosyl磁珠配制成所述第二试剂。