[发明专利]通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法

说明书

本发明公开了一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法，1)测序数据处理，2)Seurat数据过滤，3)细胞聚类分群，4)细胞群标记基因分析，本发明进行测序减少了数据前期处理的步骤，提高了分析的速度，增强了测序效率，便于操作使用，提供多种的结果展示形式，结合UMAP降维结果，更方便理解标记基因在细胞中的动态变化。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法。

背景技术

骨质疏松是一种全身骨代谢性疾病，其主要特征是骨量减少及骨微结构改变，伴随骨强度下降、骨脆性增加及骨折危险性增加等。根据流行病学统计，我国50岁以上人群中骨质疏松的患病率女性为20.7％，男性为14.4％。并且根据全球的流行病学调查，各国的骨质疏松的患病率均较高。骨质疏松的发病与多种因素相关，其中性别因素和年龄因素对骨质疏松发生的相关性最大。骨质疏松导致的疼痛和骨折严重的影响了患者的生活质量，危及患者生存，而现有的治疗手段对骨质疏松的治疗效果相对有限。在老年女性中，病理性骨折多继发于骨质疏松症之后，骨质疏松性骨折致残致死率高，目前其病死率已超过老年女性罹患乳腺癌、宫颈癌及子宫体癌病死率的总和。

目前临床上诊断骨质疏松的方法主要有：1.医生询查既往病史，通过病史提供可能患有骨质疏松的高危因素，比如酗酒，大量吸烟，绝经前双侧卵巢切除术等，然后还需要进一步的检查。2.测量骨量，以测量骨矿含量和骨密度为依据，但是骨折及骨质疏松的发生不仅仅依赖于骨量。3.超声骨测定，测量超声通过骨组织的速度，振幅衰减和硬度指数反映骨结构和骨量。

现有诊断骨质疏松的方法主要有如下缺点：1.医生询查既往病史只能提供参考，并不能准确判断是否患有骨质疏松。2.骨量测量是现在常用的手段，但是是否发生骨折主要是有骨强度决定的，而骨强度由骨量、骨质量、骨骼的构成成分及骨的外形等多方面组成，因此仅仅通过骨量进行判断也不够准确。3.超声测量的结果不是骨密度或骨矿含量，不能与真值相比，需要更多的观察资料，此外超声设备巨大不便移动，每次测量成本较高等缺点。因此一种改进的诊断骨质疏松的产品是目前市场需要的。

发明内容

本发明的提供一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法。

本发明的方案是：

一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法，包括下列步骤：

1)所需DNA样本制备，通过全血提取样本DNA，获得的样本DNA后，置于-20℃～4℃中保存待用；

2)样本DNA的qPCR扩增，取步骤1)中的样品DNA进行稀释，稀释至5～30ng/μL，然后在PCR管中构建反应体系，然后送入PCR扩增仪器中，设定好反应程序进行反应，反应完成后获得目的基因；

3)位点检测，将步骤2)中的目的基因进行检测，获得检测报告。

通过检测BsmI位点和PvuⅡ位点的碱基序列，判断骨质疏松的风险。

作为优选的技术方案，所述全血提取样本DNA如下所示：

1-mL Tip头剪去尖头，插移液器上，伸入采血管中反复吹打全血3～4次，沉淀的白细胞充分悬浮，转移全血至EP管中，加MGS裂解液，加蛋白酶K混匀，在60℃的水浴锅中加热10min～15min，混匀次数大于2次；

从水浴锅中取出EP管，将EP管内溶液全部倒入离心吸附柱中，吸附柱放入收集管内，8000rpm，离心1min，取出吸附柱，倒掉收集管中废液；

向吸附柱中加入清洗液8000rpm，离心30s，取出吸附柱，倒掉收集管中废液；