[发明专利]一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的制备方法

说明书

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的制备方法：采用刺激细胞按照不同比例刺激脐血或外周血来源的单个核细胞3周，培养过程中每3天对半更换细胞培养液，维持细胞密度为3.0×10⁶/mL，共刺激培养21天；所述刺激细胞为辐照过的EBV转化的B淋巴细胞，所述单个核细胞与刺激细胞以每周减少的比例进行，即第0天时，单个核细胞与刺激细胞的比例为40:1，第7天为20:1，第14天为5:1，每种比例分别刺激一周，共刺激三周。本发明提供的EBV‑CTL的制备方法，能够快速有效提高扩增效率，体外功能实验表明，EBV‑CTL可以特异性的杀伤EBV感染的细胞，且杀伤效率在90%以上。在临床上，对同种异体干细胞移植后受体的EBV免疫治疗具有重要的潜在意义。

技术领域

本发明属于细胞生物学与生物医药领域，具体涉及一种EBV特异性的细胞毒性T细胞（EBV-CTL）的制备方法及应用。

背景技术

EBV (Epstein-Barr virus)是疱疹病毒家族的成员。EBV诱导的淋巴组织增生性疾病是与同种异体干细胞移植相关的严重并发症。在正常宿主中，这些病毒引起自限性疾病，在免疫功能低下的个体中，尤其是同种异体T细胞耗竭（TCD）干细胞移植（SCT）的受者，EBV能够导致显著的发病率和死亡率。

据报道SCT后病毒再激活的发生率为70％至80％。在TCD-SCT后的患者中EBV诱导的淋巴组织增生性疾病（EBV-LPD）可高达20%。在这些患者中，细胞免疫在预防和控制病毒感染的过程中起着非常重要的作用，因此，恢复细胞免疫是预防病毒再激活所必需的。

免疫疗法采用体外扩增病毒特异性的细胞毒性T细胞（CTL），已被探索和证实为有效的治疗或预防EBV感染的方案。虽然存在治疗病毒感染的药物，但是这些药物有几种副作用，其中最严重的是骨髓抑制，因此，恢复宿主细胞对EBV的免疫替代疗法是有意义的。输注体外扩增、EBV特异性的CTL被证明是安全和有效的治疗和预防EBV-LPD的方案。这些发现对同种异体干细胞移植受体的EBV免疫治疗具有潜在的意义。

目前，EBV-CTL的制备方法主要有抗原肽刺激或EBV转化的细胞刺激或制备特定的培养瓶，其中抗原肽刺激得到的EBV-CTL纯度和功能都有待提高，EBV转化的刺激细胞主要为人皮肤成纤维细胞SF或树突状细胞DC，但是SF与DC作为刺激细胞制备EBV-CTL时，培养时程明显延长，至少需要2个月的时间，这将大大降低了EBV-CTL的制备效率。

综上所述，开发一种快速扩增EBV-CTL的方法显得至关重要，这将为临床上EBV的免疫治疗提供一种非常重要的治疗手段。

发明内容

针对EBV-CTL制备效率低下、成本高、时程长等现有的制备缺陷，本发明提供了一种EBV特异性的CTL的制备方法，可以显著提高EBV-CTL的扩增效率和杀伤功能。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种EBV特异性的细胞毒性T细胞（EBV-CTL）的制备方法，包括以下步骤：

采用刺激细胞按照不同比例刺激单个核细胞，刺激培养3周，收获细胞；

所述刺激细胞为辐照过的EBV转化的B淋巴细胞（fz-BLCL）。

优选的，培养过程中每3天对半更换细胞培养液，维持细胞密度为3.0×10⁶/mL。培养条件为37℃培养箱，含5%的CO₂和饱和水蒸气。

所述单个核细胞的来源为脐血或外周血，单个核细胞的分离方法可以选择本领域常规方法获得，如沉降法、商业化的淋巴细胞分离液采用梯度密度分离的方法。

所述EBV-CTL的培养液为添加5% CTS^TM的AIM V^TM培养基，第1周添加50IU/mL的IL-2，第2-3周，添加200IU/mL的IL-2。