[发明专利]一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法

说明书

本发明公开了一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：S1，取样及转运；S2，漂洗；S3，消化；S4，终止消化及过滤；S5，裂解红细胞并过滤；S6，纯化及重悬细胞；S7，细胞计数及检测；本发明方法操作简便、耗时短、稳定性好，获得的单细胞悬液细胞总数多，获得角膜及角膜缘单细胞悬液内角膜的各类细胞具有高存活率，并且总体活性大于90％，适用于单细胞领域的相关实验和原代细胞的分离培养，为角膜及角膜缘单细胞转录组测序、V(D)J免疫组库测序和ATCT染色质开放区域测序等提供高效的活细胞，进而对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，揭示角膜及角膜缘细胞命运转变过程中各类细胞转录组的时空变化规律。

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法。

背景技术

世界卫生组织(WHO)的统计数据显示，全球有超过4亿人患有视力障碍，约有4000万人失明，其中1000万人是由角膜疾病或损伤引起的。角膜由五层结构组成，即上皮、Bowman膜、基质、Descemet膜和内皮，角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells,LSCs)位于上皮基底层，尤其是Vogt栅栏区乳头状结构中的角膜缘基底细胞层，其是一组具有高增殖潜能的细胞群，也是角膜上皮增殖和移行的动力来源，并且可以有效地修复角膜，维持角膜的光学特性。将自体LSC进行体外扩增、移植等治疗方式可以有效解决角膜资源不足、免疫排斥和终生免疫抑制药物的使用等限制。因此，研究眼部组织，特别是角膜的结构和功能有助于延缓和减少眼部疾病的发生，并提高眼疾的治愈率。随着单细胞技术在生物科学领域取得的巨大突破，生物学界用细胞异质性不断补充或颠覆用团块组织平均水平所诠释的生物学机制，在单细胞水平上更加精准地阐释机理。目前的研究过程中需要将眼角膜及角膜缘消化成单细胞悬液，然后通过单细胞测序，分析眼角膜及角膜缘的细胞异质性，为防盲治盲提供技术支撑。

目前针对眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法存在较大的缺陷，相关文献介绍的制备方法存在步骤繁琐、消化时间过长、细胞聚团、细胞总数少及细胞活性低等缺陷，理论上证明，部分细胞群体，如角膜缘干细胞只占细胞总数的3％，上述问题将造成丢失细胞过多、检查结果失真；并且眼角膜含有大量的胶原纤维，消化若没处理好，会堵塞管道，损坏精密仪器。这使得单细胞悬液制备成为眼角膜及角膜缘单细胞测序的技术难点。单细胞悬液制备不合格，达不到上机要求，将无法进行后续实验。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，主要用于解决对眼角膜进行单细胞转录组测序时单细胞悬液制备成功率低的问题，该技术可为单细胞转录组测序、V(D)J免疫组库测序、ATCT染色质开放性测序等提供优质的活细胞，然后进行生物信息学分析，揭示角膜及角膜缘单细胞的异质性，以揭示眼部发育和疾病发展的时空信息。

本发明的一个目的在于提供一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法。

所述制备方法包括如下步骤：

S1，取样及转运：将离体的眼角膜及角膜缘组织快速浸泡入装有人组织移植保存液中的容器中，所述容器置于冰上并加保温棉隔离保存运输，保存及转运时间不超过48h；

S2，漂洗：将步骤S1中的眼角膜及角膜缘组织用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液清洗，去除所述眼角膜及角膜缘组织的周围组织和残渣；

S3，消化：将步骤S2中得到的眼角膜及角膜缘组织剪碎，并加入消化酶，放入摇床进行震荡消化；

S4，终止消化及过滤：向步骤S3中的组织消化液中加入含血清的PBS缓冲液终止消化，过滤、离心富集细胞，回收沉淀；

S5，裂解红细胞并过滤：向步骤S4中的沉淀中加入红细胞裂解液，待裂解充分后，进行过滤、离心，得到细胞沉淀；