[发明专利]一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法

权利要求书

1.一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，取样及转运：将离体的眼角膜及角膜缘组织快速浸泡入装有人组织移植保存液中的容器中，所述容器置于冰上并加保温棉隔离保存运输，保存及转运时间不超过48h；

S2，漂洗：将步骤S1中的眼角膜及角膜缘组织用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液清洗，去除所述眼角膜及角膜缘组织的周围组织和残渣；

S3，消化：将步骤S2中得到的眼角膜及角膜缘组织剪碎，并加入消化酶，放入摇床进行震荡消化；

S4，终止消化及过滤：向步骤S3中的组织消化液中加入含血清的PBS缓冲液终止消化，过滤、离心富集细胞，回收沉淀；

S5，裂解红细胞并过滤：向步骤S4中的沉淀中加入红细胞裂解液，待裂解充分后，进行过滤、离心，得到细胞沉淀；

S6，纯化及重悬细胞：将步骤S5中的细胞沉淀进行洗涤纯化过程，清除坏死细胞，然后用PBS缓冲液洗重悬细胞，制得眼角膜及角膜缘单细胞悬液；

S7，细胞计数及检测：取步骤S6中制得的眼角膜及角膜缘单细胞悬液加到Countstar细胞计数分析仪中进行检测，得到单细胞悬液的性能指标数据。

2.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的移植保存液为含有质量浓度为10％胎牛血清的HBSS缓冲液或者角膜移植片保存液中的一种。

3.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中眼角膜及角膜缘组织剪碎具体操作如下：用生理盐水或者PBS缓冲液中的一种沾湿纱布并紧密包裹眼球巩膜部分，暴露角膜部分；用手术刀或者针头刺破角膜缘外缘，将角膜剪开、并深入该切口，沿角膜缘外缘剪下角膜，将所述角膜放入不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液中，剪碎成浆糊状。

4.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中消化具体步骤为：将剪碎的眼角膜及角膜缘组织加入到含有消化酶的缓冲液体系中，摇匀，置于摇床中震荡消化30-45分钟，摇床运行参数为37℃、150rpm。

5.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中过滤器的筛网粒径为40μm，所述离心的具体条件为：4℃、1200rpm，离心5min。

6.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中过滤器的筛网粒径为40μm，所述离心的具体条件为：4℃、1200rpm，离心5min。

7.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中重悬细胞具体操作过程为：用含有质量浓度为2％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，然后过滤、离心，重复2次，最后制得眼角膜及角膜缘单细胞悬液。

8.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中单细胞悬液的性能指标数据包括：细胞活率、总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度、总细胞个数、活细胞个数、死细胞个数、平均直径。

9.如权利要求1所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1-S6均在无菌条件下操作，制得单细胞悬液，所述单细胞悬液用于原代细胞的培养。

10.一种眼角膜及角膜缘单细胞悬液，其特征在于，所述眼角膜及角膜缘单细胞悬液是根据权利要求1-9项中任一项所述的眼角膜及角膜缘单细胞悬液的制备方法所制得。