[发明专利]一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法

说明书

本发明提供了一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的固体核磁共振方法，属于生物物理和生物化学技术领域，包括：对膜融合蛋白进行¹⁵N稳定同位素标记，将¹⁵N标记蛋白分别与顺磁脂质体和非顺磁脂质体反应，得到蛋白‑脂质体复合物。其中顺磁脂质体含有一定比例的络合镧系金属离子的顺磁磷脂分子，而非顺磁脂质体不含有顺磁磷脂分子。通过采集蛋白‑脂质体复合物的固体核磁共振谱图，对比在顺磁和非顺磁脂质体中的一维¹⁵N固体核磁共振图谱，进而利用信号强度的对比获取膜融合蛋白在脂质体中的定位，即区分膜融合蛋白在脂质体内部或在其表面。采用本发明提供的核磁共振方法能够检测膜融合蛋白在脂质体中的定位。

技术领域

本发明属于生物物理和生物化学技术领域，尤其涉及一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法。

背景技术

细胞膜融合是生物体常见的生理现象，广泛存在于各种生命系统中。通过细胞膜融合，两套独立的双层脂分子合二为一，完成一定的生物功能。例如：成肌细胞的融合产生骨骼肌、破骨细胞的融合产生骨以及滋养细胞的融合产生胎盘；在先天免疫应答中，巨噬细胞融合形成多核巨细胞，吞噬并摧毁病原体。异常的细胞膜融合则与人类的疾病密切相关。膜融合通常不会自发发生，需要在膜融合蛋白的诱导下实现细胞膜的融合，有些膜融合过程通过同一蛋白完成，如：病毒侵染时的融合¹，而某些膜融合过程则需要多个蛋白形成复合物驱动，如：SNARE复合物驱动的膜融合^2,3等。因此，探索不同膜融合蛋白的机理和融合反应的分子机制，有助于对生命现象本质的深入了解。膜融合的机理非常复杂，为了描述这一过程，需要对膜融合蛋白的结构、蛋白与膜间的相互作用、以及膜融合蛋白在细胞膜上的拓扑结构进行详细的表征。研究蛋白结构的技术主要包含X-ray晶体衍射技术、冷冻电镜技术、液体核磁共振技术和固体核磁共振技术四种。在膜融合蛋白-脂质体复合物中，由于脂质体的存在，限制了X-ray晶体衍射技术和冷冻电镜技术的应用；由于脂质体体积较大，液体核磁共振技术则受到了分辨率的限制。

固体核磁共振技术可以研究多种形态的样品，广泛地应用于膜蛋白的结构解析，因此适用于融合反应后膜融合蛋白-脂质体复合物中的蛋白的结构研究。然而在膜融合蛋白的拓扑结构鉴定方面，即分析膜融合蛋白在细胞膜中的定位方面，依然存在着技术挑战。首先，由于膜融合体系的不均匀性，对样品体系有序性要求很高的Orient Sample NMR(OS-NMR)技术不适用；其次，基于固体NMR的H/D交换实验可以获取膜蛋白与顺磁性分子或水分子的相互作用，间接获取拓扑结构，但不适合鉴定细胞膜与蛋白的相互作用。因此，需要发展一种新方法用于膜融合体系中膜融合蛋白的定位。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，采用本发明提供的核磁共振方法能够检测膜融合蛋白在脂质体中的定位。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，包括以下步骤：

1)对膜融合蛋白进行¹⁵N标记，得到标记蛋白，将所述标记蛋白与不同类型脂质体反应，得到蛋白-脂质体复合物；

2)对所述步骤1)得到的蛋白-脂质体复合物进行固体核磁共振，采集一维¹H-¹⁵N固体核磁图谱。其中包括与一定比例的络合镧系金属离子的顺磁磷脂分子的顺磁脂质体，和不含有顺磁磷脂分子的非顺磁脂质体。根据一维¹H-¹⁵N固体核磁图谱在不同类型脂质体中的对比，分析膜融合蛋白在脂质体中的定位；