[发明专利]一种利用基因编辑技术获得高油酸植株的方法

说明书

本发明涉及一种利用基因编辑技术获得高油酸植株的方法，属于植物基因工程技术领域，主要包括三个部分：首先，为了提高基因编辑效率，利用AtKASII启动子驱动Cas9基因表达；其次，为了提高油酸含量，同时降低亚油酸和亚麻酸含量，选择将mFAD2‑1A，GmFAD2‑1B和GmFAD3A作为靶基因，并设计两个靶序列插入载体中；最后，通过对大豆籽粒中脂肪酸组分分析，以及分子鉴定和测序分析筛选得到三基因纯合突变的高油酸大豆植株。本发明为高油酸含量的油料作物品质育种工作提供了一种全新的途径，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及一种利用基因编辑技术获得高油酸植株的方法。

背景技术

大豆(Glycine mas L.Merrill)起源于中国，是世界上重要的油料和经济作物之一，也是人类植物油和植物性蛋白的主要来源。随着生活水平的提高以及饮食结构的改善，人们对优质大豆油的需求日益增长，培育高品质大豆成为大豆育种的重要目标之一。大豆油约占我国植物食用油消费的40％，大豆脂肪酸的组分及其配比决定大豆油脂的品质，其主要由棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)5种脂肪酸组成，分别约占大豆脂肪酸总量的10％、4％、18％、55％和13％。其中，硬脂酸、棕榈酸为饱和脂肪酸；油酸、亚油酸、亚麻酸为不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸不容易被人体消化吸收，易引起肥胖症及心脑血管疾病。亚油酸、亚麻酸是多不饱和脂肪酸，稳定性差，在高温加工时易氧化，使营养价值降低，影响油的品质，在工业上的加氢反应也易产生对人体有害的反式脂肪酸。而油酸作为一种单不饱和脂肪酸，性质稳定，抗氧化作用强，在人体的脂类代谢中能降低有害胆固醇，保持有益胆固醇，从而减缓动脉粥样硬化，有效预防心血管疾病发生的机率。所以，油酸是平衡油脂营养及化学稳定性矛盾的首选脂肪酸。因此，提高油酸的相对含量，增加油酸/亚油酸的比值，已成为大豆品质改良育种的重要目标之一。

在脂肪酸合成途径中，Δ12-脂肪酸脱饱和酶(deltatwelve fatty aciddesaturase 2enzyme,FAD2)是催化油酸转化为亚油酸的关键酶。已有研究表明抑制FAD2基因表达从而降低种子中脂肪酸脱氢酶的活性，便能抑制油酸向亚油酸转化，从而使种子中的油酸增加。目前,拟南芥、棉花、向日葵、大豆等植物中的FAD2基因已经被克隆。大豆中存在两类FAD2基因,即FAD2-1和FAD2-2(FAD2-2A，FAD2-2B，FAD2-2C、FAD2-2D和FAD2-2E)，其中FAD2-1又包含FAD2-1A和FAD2-1B，这两个基因在种子中特异性表达,是决定种子油酸含量的两个主要基因。

同时，改良大豆油品质的另一常用手段是通过降低亚麻酸含量来减少多不饱和脂肪酸的比例，而FAD3是催化亚油酸转化为亚麻酸的关键酶。大豆FAD3基因家族由三个成员组成，分别为FAD3A，FAD3B，和FAD3C。由于FAD3A基因在大豆籽粒发育过程中大量表达，因此，它是影响大豆油脂中亚麻酸含量的主要因素。

CRISPR/Cas9系统是近几年开发的一种准确、便捷、高效率的生物基因组编辑方法。通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑。该技术不仅对基因功能的研究提供了新思路，更广泛的应用于生物医药的研发和农作物的遗传改良等领域。目前，CRISPR/Cas9系统已经成功应用在拟南芥、水稻、玉米、小麦、大豆等植物中。CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅能够快速、便捷的实现基因的靶向突变，更能高效的聚合作物某些优良农艺性状，为作物育种提供创新高效的新途径。

发明内容