[发明专利]一种利用基因编辑技术获得高油酸植株的方法

权利要求书

1.AtKASII启动子在提高油料作物中CRISPR/Cas9基因编辑效率方面的应用，所述AtKASII启动子为拟南芥AtKASII基因的启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO: 03所示。

2.AtKASII启动子在利用CRISPR/Cas9基因编辑系统改造油料作物中脂肪酸组分方面的应用，所述AtKASII启动子为拟南芥AtKASII基因的启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO: 03所示。

3.一种双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：包括依次顺序连接的双靶点表达元件、Cas9蛋白基因、mCherry荧光蛋白基因和草甘膦筛选标记基因；所述双靶点表达元件包括靶序列S2和靶序列S3，所述靶序列S2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 04所示，所述靶序列S3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 05所示；所述Cas9蛋白基因的启动子为AtKASII启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO: 03所示。

4.一种转化体，包含权利要求3所述的双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体。

5.一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获取高油酸植株的方法，其特征在于：CRISPR/Cas9基因编辑系统采用权利要求3所述的双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、构建双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体：设计引物ZYP22和ZYP23克隆AtKASII启动子，所述引物ZYP22的序列如SEQ ID NO: 01所示，所述ZYP23的序列如SEQ ID NO: 02所示；对GmFAD2-1A和GmFAD2-1B的基因序列进行比对，在相同的区域设计并选取得到靶序列S2；对GmFAD3A、GmFAD3B和GmFAD3C的基因序列进行比对，在GmFAD3A的序列特异性区域设计并选取得到靶序列S3；利用靶序列S2和靶序列S3构建双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体；

所述靶序列S2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 04所示；

所述靶序列S3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 05所示；

所述GmFAD2-1A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 06所示；

所述GmFAD2-1B的核苷酸序列如SEQ ID NO: 07所示；

所述GmFAD3A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 08所示；

步骤二、转化大肠杆菌感受态，Kan板筛选，菌落PCR鉴定阳性；

步骤三、将经步骤二鉴定阳性的单克隆，抽提质 粒，测序正确后转化农杆菌；

步骤四、将经步骤三获得的阳性农杆菌介导油料作物转化，获得转基因阳性植株；

步骤五、对转基因阳性植株的T2代籽粒进行脂肪酸组分分析，通过与野生型植株进行比较，获得油酸含量高的转基因株系；

步骤六、对步骤五获得的转基因株系的籽粒进行种植，通过分子鉴定和测序分析，筛选获得GmFAD2-1A，GmFAD2-1B和GmFAD3A基因同时发生突变且不含有Cas9基因的高油酸植株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤四所述油料作物包括大豆、花生、油菜和向日葵。