[发明专利]新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒全预混冻干多重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的多重荧光PCR快速检测试剂盒，包括冻干固态RT‑PCR Mix，液态复溶Buffer、冻干固态阳性对照、冻干固态阴性对照，所述冻干固态RT‑PCR Mix含有SARS‑CoV‑2特异性基因ORF1ab、甲型流感M基因、乙型流感M基因和人源内参基因RNAse P引物序列对应的引物组，本试剂盒将多重荧光定量PCR技术和冷冻干燥工艺相结合，利用3对特殊引物和人源内参基因，体外扩增3种病原体的特异性序列，并结合荧光探针进行实时检测。并且该检测方法操作简便，对检测人员的操作水平要求低，可一次性检测3种常见的呼吸道病原体，大大节约检测时间和检测成本，实现大批量样本的快速筛选，全程检测仅需40分钟‑1小时，结果准确可靠。

技术领域

本发明属于体外诊断、生物检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒全预混冻干多重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

2019冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(new Corona Virus，SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道传染病。SARS-CoV-2属于β属的新型冠状病毒，为RNA病毒，其有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状，另外2种是致病性较高的SARS冠状病毒和MERS冠状病毒。

流行性感冒病毒(Influenzavirus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中甲型流感病毒可自然感染人和多种动物，常突然发生、传播迅速，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒在自然情况下仅感染人，一般呈散发、爆发或小流行；丙型流感病毒常感染儿童，多呈散发、偶发或爆发，但不流行。甲型流感病毒的表面抗原血凝素(HA)个神经氨酸酶(NA)容易变异，已知HA有16个亚类(H1-H16)，NA有9个亚类(N1-N9)，它们之间的随意组合可形成多种亚型，各亚型之间无交叉免疫力。这种变异特性给流感的诊断和防控造成很大困难。

秋冬季节是流感高发时间段，在当前新冠全球流行的态势下，非常需要把流感和新冠肺炎区分开，进行有针对性的治疗，提高治愈率。但目前普遍采用的方法是，对病人采样后，首先检测新冠肺炎，然后再检测各亚型流感，这样既消耗时间，又因为样品的反复冻融，影响病毒的检出率。所以，市场急需要一种敏感性高、特异性强、可同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒等3种常见呼吸系统疾病病原的方法和试剂盒。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒及其检测方法。

本发明的第一个方面提供了新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒三重荧光PCR快速检测试剂盒，包括冻干固态RT-PCR Mix，液态复溶Buffer、冻干固态阳性对照、冻干固态阴性对照和病毒RNA提取试剂，所述冻干固态RT-PCRMix含有SARS-CoV-2特异性N gene、甲型流感M基因、乙型流感M基因和人源内参基因RNAse P引物序列对应的引物组。

在一些实施例中，所述引物组为四组引物和探针，所述引物和探针的序列如下表：

在一些实施例中，所述第一组合中的引物为第1引物组，所述第1引物组用于检测新型冠状病毒2019-nCoV；所述第二组合中的引物为第2引物组，所述第2引物组用于检测甲型流感病毒；所述第三组合中的引物为第3引物组，所述第3引物组用于检测乙型流感病毒；所述第四组合中的引物为第4引物组，所述第4引物组检测内标基因RNaseP。