[发明专利]新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒全预混冻干多重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：包括冻干固态RT-PCR Mix，液态复溶Buffer、冻干固态阳性对照、冻干固态阴性对照和病毒RNA提取试剂，所述冻干固态RT-PCR Mix含有SARS-CoV-2特异性N gene、甲型流感M基因、乙型流感M基因和人源内参基因RNAse P引物序列对应的引物组。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述引物组为四组引物和探针，所述引物和探针的序列如下表：

3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述第一组合中的引物为第1引物组，所述第1引物组用于检测SARS-CoV-2；所述第二组合中的引物为第2引物组，所述第2引物组用于检测甲型流感病毒；所述第三组合中的引物为第3引物组，所述第3引物组用于检测乙型流感病毒；所述第四组合中的引物为第4引物组，所述第4引物组用于检测内标基因RNaseP。

4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述冻干固态RT-PCR Mix在冻干前全预混混合液中含有dATP、dGTP、dCTP、dUTP、Taq DNA聚合酶、MMLV逆转录酶、RNase抑制剂、UDG酶、N基因-F/R/P、InfA M基因-F1/F2、InfA M基因-R1、InfA M基因R2、InfA M基因P、InfB M基因-F/R/P、RNase P-F/R/P以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白(w/v)、1mmol/L-5mmol/L DTT、0.1-0.3％Proclin 300、0.1-1％甲酰胺的冻干复合保护剂。

5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述冻干固态RT-PCRMix在冻干前的全预混液中混合液中：第1检测组引物探针浓度分别为200nM、200nM、100nM，第2检测组引物探针浓度分别为300nM、300nM、200nM；第3检测组引物探针浓度分别为500nM、500nM、300nM；第4检测组引物探针浓度分别为500nM、500nM、600nM。

6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述液态复溶Buffer含有MgSO4、KCl、Tris-HCl、(NH4)2SO4、TritonX-100以及甜菜碱。

7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述冻干固态阳性对照为体外合成的一条含有SARS-CoV-2特异性基因N、甲型流感M基因、乙型流感M基因特异片段的冻干粉状固态RNA；所述冻干固态阴性对照为提纯的非SARS-CoV-2N基因、甲型流感M基因、乙型流感M基因所对应的冻干固态RNA。

8.权利要求1所述的新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的三重荧光PCR快速检测方法，其特征在于：使用方法包括以下步骤：

(1)模版RNA提取，采用核酸提取盒提取待测样品RNA；

(2)试剂准备：向每个含有全预混冻干颗粒的PCR管中加入15μL复溶Buffer RB；

(3)加入样品与对照：根据实验样品数量，每管分别加入5μL提取后的样品RNA、阴性对照和阳性对照；

(4)离心并放入荧光定量PCR仪内进行PCR扩增；

(5)结果判定。