[发明专利]牛血清白蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及牛血清白蛋白的制备方法。本发明提供的BSA的制备方法中，包括：血清稀释、第一步提取、第二步提取、洗滤浓缩几个步骤。实验表明，采用本发明提供的方法在适宜的参数下，能够获得良好的提取效果，不仅收率较高，并且批间差异小，降低了化学残留，提高了抗干扰能力，所得产品作为检测试剂的关键辅料蛋白，能够显著降低检测试剂的非特异性吸附。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及牛血清白蛋白的制备方法。

背景技术

牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)，是牛血清中的主要蛋白成分，分子量66-68KD，等电点4.7，由583个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一个自由巯基；BSA含氮量16％，含糖量0.08％(仅含已糖和已糖胺)，含脂量只有0.2％。BSA又称为组分V，或Cohn V，名称起源于BSA最早的分馏法—Cohn冷乙醇法，Cohn冷乙醇法最早是由哈佛大学Edwi Cohn教授于1946年发明的，当时基于战争创伤治疗对注射级别蛋白的大规模需求，Cohn教授在较低的温度下改变血浆的乙醇浓度和pH值，使其所含蛋白在不同乙醇浓度下析出，在第五个析出的组分中主要成分为BSA，所以BSA又称组分V或CohnV，Cohn法仍然是目前非常普遍的BSA分馏法。除了冷乙醇法外，目前常用的提取方法还有硫酸铵盐析法，色谱层析法，直接加热法，利凡诺法等。

成年牛血清中BSA含量约55％，胎牛和新生牛BSA含量约70％，但考虑到原料来源和动物保护法等原因，BSA的提取主要是以成年牛血清为原料进行。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用。鉴于BSA上述功能，其在生化试验、遗传工程、医药研究和体外诊断试剂中的应用越来越广泛：①由于蛋白质在低浓度下不稳定或活性较低，加入一定量的BSA可以起到“保护”或“载体”作用，降低目标蛋白的分解，维持其正确的空间结构，某些情况下甚至可进一步提高目标蛋白的活性；②BSA是酶的稳定剂，可以防止酶的分解和非特异性吸附；③在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用；④在诊断试剂上可作为酶结合物、校准品/标准品/质控品、阴/阳性对照品稀释液的主要蛋白，提供生理缓冲条件，同时对目标蛋白起到保护作用，但不参与反应。

BSA广泛的应用于诊断试剂领域，但目前不同厂家的制备工艺不同可造成产品特性不同，甚至同一厂家不同批次的BSA都存在明显差异，主要表现为：外观颜色不同、纯度不同、溶液中颗粒度不同等，因此导致在以BSA作为辅料蛋白的产品中性能存在明显差异，例如存在特异性差，本底高和稳定性差等问题，难以满足临床需求。

发明内容

鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种纯度高、批间差异小的牛血清白蛋白的制备方法。

本申请牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：包括：

血清稀释：将牛血清或牛血浆稀释至蛋白浓度为40～45mg/ml；

第一步提取：在稀释后的血清中加入辛酸钠至质量分数为3.5‰～4‰，边加入边搅拌，然后调节pH值至5.8～6.8，加热至65～70℃保温4h，冷却至室温放置12～16h，然后分离上清液A；

第二步提取：在上清液A中加入辛酸钠至质量分数为2‰～2.5‰，边加入边搅拌；然后调节pH值至5.0～5.5，加热65～70℃保温2h，冷却至室温放置12～16h，然后分离上清液B；

洗滤浓缩：调节上清液B的pH值至7.0～7.5，过滤、浓缩至蛋白浓度为150～180mg/ml后，经冷冻干燥获得牛血清白蛋白。

本发明中，所述血清稀释步骤中：所述牛血清或牛血浆为成年牛的血清或血浆；所述稀释采用经0.22μm过滤的纯化水。