[发明专利]一种实时荧光定量PCR引物及其应用

说明书

本发明公开了一种实时荧光定量PCR引物及其应用，所述引物包括根据慢病毒载体感染元件WPRE设计的荧光定量PCR引物和根据内参基因GAPDH设计的荧光定量PCR引物。本发明方法可用于绝对定量QPCR检测慢病毒滴度，操作简便，能够快速、准确、低成本地检测各类慢病毒滴度，尤其是不带荧光慢病毒的滴度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR(Real-timeQuantitative PCR Detecting System，QPCR)引物及其应用。

背景技术

慢病毒载体(Lentiviral veCtor，LVs)是基于HIV病毒改造而成的病毒载体，能高效地将目标基因片段导入各类组织与细胞系。慢病毒载体主要用于一些难转染地细胞，由于目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂，慢病毒载体介导的基因表达作用持续且稳定。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有独特的优势。目前，慢病毒广泛运用于各类组织或细胞的研究中，如脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。

基于不同的用途，慢病毒有不同的版本，不同的架构。无论何种目的，何种骨架，慢病毒在使用时都必须准确地检测病毒滴度。目前，慢病毒滴度常用的检测方法包括荧光报告基因检测法(如GFP、RFP等)、基于慢病毒外壳蛋白进行的抗原抗体检测法(如P24)、检测逆转录酶活性的酶活法等。这些方法各有优劣势：抗原抗体检测法试剂盒昂贵，检测成本高；酶活法检测耗时费力，病毒用量多；荧光报告基因法简单实用，是目前使用最广泛的方法。但是很多载体不带荧光，以及在特定条件下不能使用荧光标记，因此，需要建立一种快速、简便、准确的慢病毒滴度检测方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种实时荧光定量PCR引物，能够快速、简便、准确的检测慢病毒滴度。

本发明还提出上述引物筛选的方法。

本发明还提出上述引物的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的实时荧光定量PCR引物，所述引物包括根据慢病毒载体感染元件WPRE设计的实时荧光定量PCR引物和根据内参基因GAPDH设计的实时荧光定量PCR引物。

根据本发明的一些实施方式，利用Primer Premier5.0软件，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则，对慢病毒载体感染元件WPRE设计出5对荧光定量特异引物，所述慢病毒载体感染元件WPRE的荧光定量特异引物为：

WPRE-QPCR1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

WPRE-QPCR1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

或

WPRE-QPCR2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

WPRE-QPCR2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

或

WPRE-QPCR3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

WPRE-QPCR3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

或

WPRE-QPCR4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

WPRE-QPCR4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

或

WPRE-QPCR5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；