[发明专利]一种实时荧光定量PCR引物及其应用

权利要求书

1.一种实时荧光定量PCR引物，其特征在于；所述引物包括根据慢病毒载体感染元件WPRE设计的实时荧光定量PCR引物和根据内参基因GAPDH设计的实时荧光定量PCR引物。

2.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物，其特征在于；所述慢病毒载体感染元件WPRE的荧光定量特异引物为：

WPRE-QPCR1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

WPRE-QPCR1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

或

WPRE-QPCR2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

WPRE-QPCR2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

或

WPRE-QPCR3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

WPRE-QPCR3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

或

WPRE-QPCR4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

WPRE-QPCR4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

或

WPRE-QPCR5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

WPRE-QPCR5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

3.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物，其特征在于；所述内参基因GAPDH的荧光定量引物为：

GAPDH-QPCR1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

GAPDH-QPCR1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

或

GAPDH-QPCR2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

GAPDH-QPCR2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

或

GAPDH-QPCR3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

GAPDH-QPCR3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

4.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物的应用，其特征在于：所述应用为将所述引物用于检测慢病毒滴度。

5.如权利要求4的应用，其特征在于：所述慢病毒包括荧光慢病毒载体包装病毒和/或不带荧光慢病毒载体包装病毒。

6.一种无荧光慢病毒滴度的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、用待测样品感染靶细胞，并提取感染后所述靶细胞中的基因组DNA，其中所述待测样品中含有重组慢病毒；

S2、测定所述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及GAPDH基因的拷贝数；

S3、根据所述WPRE元件的拷贝数和所述GAPDH基因的拷贝数计算平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数；

S4、分别使用带荧光及不带荧光的慢病毒载体包装病毒，收集并纯化上清病毒颗粒；

S5、根据所述靶细胞的总数和所述平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数计算单位体积的所述待测样品中含重组慢病毒的颗粒数，得到所述待测样品中重组慢病毒的滴度。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及GAPDH基因的拷贝数测定步骤包括：将所述基因DNA中WPRE元件引物混合进行实时定量PCR扩增反应，获取所述WPRE元件的Ct值；将所述基因DNA中GAPDH基因引物混合进行实时定量PCR扩增反应，获取所述WPRE元件的Ct值；将所述WPRE元件和GAPDH基因Ct值代入对应标准曲线中，获得基因组中所述WPRE元件和GAPDH基因的含量；根据所述WPRE元件的含量计算所述基因组DNA中所述WPRE元件的拷贝数，以及根据所述GAPDH基因的含量计算所述基因组DNA中所述GAPDH基因的拷贝数。