[发明专利]一种同时制备苦瓜α-MMC和MAP30的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时制备苦瓜α‑MMC和MAP30的方法。针对现有技术中，制备单一种类苦瓜RIP的方法存在的缺陷，本发明提供了同时制备苦瓜α‑MMC和MAP30的方法，其包括如下步骤：制备酶粗提取液、选择性热变性和酸碱变性、硫酸铵粗分级分离、离子交换与亲合色谱分离和疏水色谱分离。本发明还提供上述方法制备的α‑MMC和/或MAP30及其用途。本发明方法实现了同时从苦瓜中提取纯MAP30和α‑MMC，且得到的纯MAP30和α‑MMC的活性与现有同类产品活性相当，且提取的收率高，步骤简单，操作简便，成本低廉，适宜于工业化大规模生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时制备苦瓜α-MMC和MAP30的方法。

背景技术

核糖体失活蛋白(ribosome inactivating protein，RIP)是一类作用于rRNA而抑制核糖体功能的毒蛋白，广泛分布于高等植物。根据RIPs分子结构和所含肽链数量的差异，可将RIPs分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。I型RIPs由具有RNA N-糖苷酶活性的一条单肽链构成。苦瓜RIPs主要有α-苦瓜素(α-MMC)、MAP30、γ-苦瓜素等几种，均属于单链I型RIPs。其中，α-MMC和MAP30具有抗菌、广谱抗病毒和抗肿瘤作用，受到人们的广泛关注并已经逐渐应用于提高农作物抗性、疾病治疗和医药研究等方面。

此外，已有研究者将苦瓜提取物作为化妆品中的有效成分。中国专利“CN200810147317.2苦瓜叶提取物及其在化妆品中的应用”将苦瓜叶提取物加入化妆品中，具有祛痘、美白祛斑的功效。“CN202010316614.6抗皱修复用苦瓜胜肽及其制备工艺”将苦瓜胜肽加入化妆品中，具有抗糖化减少皱纹的功效。虽然苦瓜已经用于化妆品，但是，目前报道的应用中，主要的活性成分为苦瓜多糖、苦瓜胜肽等，而苦瓜RIPs的美容养颜作用还未被人们发现。

而蛋白质在化妆品中也有广泛的应用，中国专利“CN202010643785.X一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法和在蛋白质防晒剂制备中的应用”公开了部分蛋白质对紫外光具有较强的吸收，因而可以被用于防晒产品。因此，苦瓜中的RIPs同样具有在化妆品中应用的潜力。

为了深入研究α-MMC和MAP30的结构与功能乃至实际应用，首先亟待解决的问题就是大量纯样品的供给。目前，常规的α-MMC和MAP30纯样品的制备通常采用从苦瓜种子中分离和纯化的方法。其步骤主要是首先制成酶粗提取液，然后进行分离纯化得到单一种类的RIP(S.Lee-Huang,FEBS Lett.272(1-2):12-18,1990)。

上述方法存在的问题主要是分离纯化步骤繁多，且提取的收率低，例如文献W.P.Fong,Life Sci.59(11):901-909,1996中，每2.5g苦瓜种子中仅能够提取得到3.1mgα-MMC，收率仅为0.12％。这严重制约了RIP的应用。

发明内容

针对现有技术中制备单一种类的苦瓜RIP的方法中存在的缺陷，本发明提供一种同时制备苦瓜α-MMC和MAP30的方法，其目的在于：通过简单的分离纯化方法同时制备苦瓜α-MMC和MAP30两种RIPs。

一种同时制备苦瓜α-MMC和MAP30的方法，包括如下步骤：

(1)制备苦瓜种子的酶粗提取液；

(2)对酶粗提取液进行选择性热变性处理，分离收集上清液；

(3)加入酸进行变性，分离收集上清液；

(4)对步骤(3)得到的上清液进行硫酸铵粗分级；

(5)依次用离子交换柱和亲和色谱柱分离步骤(4)得到的目的蛋白洗脱峰样品液；

所述离子层析柱为SP Sepharose XL或CM-cellulose-52，洗脱液为含有NaCl的pH6.0-7.0Tris-HCl缓冲液；