[发明专利]一种同时制备苦瓜α-MMC和MAP30的方法

权利要求书

1.一种同时制备苦瓜α-MMC和MAP30的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备苦瓜种子的酶粗提取液；

(2)对酶粗提取液进行选择性热变性处理，分离收集上清液；

(3)加入酸进行变性，分离收集上清液；

(4)对步骤(3)得到的上清液进行硫酸铵粗分级；

(5)依次用离子交换柱和亲和色谱柱分离步骤(4)得到的目的蛋白洗脱峰样品液；

所述离子交换柱为SP Sepharose XL或CM-cellulose-52，洗脱液为含有NaCl的pH6.0-7.0Tris-HCl缓冲液；

所述亲和色谱柱为Blue Sepharose CL 4B、Blue-Sephadex或DEAE Affi-Gel BlueGel，洗脱液为含有NaCl的pH6.5-7.5Tris-HCl缓冲液；

(6)用疏水色谱分离柱分离步骤(5)得到的蛋白洗脱峰样品液，得到两个蛋白洗脱峰样品液，分别为α-MMC和MAP30；

所述疏水色谱分离柱为Phenyl Sepharose、Butyl-Sepharose或Octyl-Sepharose；

洗脱液A相为pH6.8-7.2磷酸缓冲液，B相为含有硫酸铵的pH6.8-7.2磷酸缓冲液；

步骤(1)具体过程为：取脱壳苦瓜种子粉碎后与丙酮在低温下混合，分离沉淀，加入含NaCl的磷酸缓冲液提取，再次分离上清液，即得酶粗提取液；

步骤(2)中，加热变性的条件为50-53℃处理10-20min；

步骤(3)中，所述酸为HCl，加酸调节pH至3.5±0.2，分离收集上清液后用碱调节pH至6.5±0.5；

步骤(6)中，用疏水色谱分离柱分离步骤(5)得到的蛋白洗脱峰样品液之前进行如下操作：将蛋白洗脱峰样品液超滤脱盐并交换成pH 6.8-7.2 0.1M磷酸缓冲液体系，然后加入硫酸铵；

所述洗脱过程中，硫酸铵浓度梯度为由1.5M至0线性逐降的方式进行。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，加热变性的条件为52℃处理15min。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)具体过程为：

(4.1)向步骤(3)得到的上清液中加入硫酸铵达25-30％饱和度，放置，收集上清液；

(4.2)继续加入硫酸铵达65-75％饱和度，再次放置，收集沉淀；

(4.3)所述沉淀用pH6.0-7.0Tris-HCl缓冲液溶解，透析脱盐，收集上清液。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述离子交换柱用pH6.0-7.0Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液平衡，洗脱液为含有0.9％NaCl的pH6.0-7.0Tris-HCl缓冲液；

和/或，所述亲和色谱柱用pH6.5-7.5 0.05M Tris-HCl缓冲液平衡，洗脱过程为先用含有0.15M NaCl的pH 6.5-7.5 0.05M Tris-HCl缓冲液洗脱至280nm吸收值达恒定，再用含有0.5M NaCl的pH6.5-7.5 0.05M Tris-HCl缓冲液洗脱。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，

所述亲和色谱柱为Blue Sepharose CL 4B柱；

和/或，所述离子交换柱为SP Sepharose XL柱，所述Sepharose CL 4B柱的介质为Sepharose CL 4B与Cibacron Blue F-3GA。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述Sepharose CL 4B与Cibacron BlueF-3GA的用量比例为20g：18-22ml；和/或，所述Cibacron Blue F-3GA的浓度为质量分数2.0-3.0％；和/或，所述Sepharose CL 4B、NaCl和碳酸钠的用量比例为20g﹕0.3-0.5g﹕0.15-0.25g；和/或，所述NaN₃溶液的浓度为质量分数0.03％。