[发明专利]能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒、病毒样颗粒及其制备方法

说明书

本发明属于生物领域，公开了一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：步骤1：扩增鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因后与pFastBac 1载体连接，连接产物转入DH5α感受态中，筛选阳性克隆获得重组质粒pFastBac 1‑VP2，将测序正确的pFastBac 1‑VP2转入DH10 Bac感受态中获得重组质粒Bacmid‑IBDV‑VP2；步骤2：将Bacmid‑IBDV‑VP2转入SF9细胞，收获重组杆状病毒。本发明采用鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)作为VP2基因的来源病毒株，其能表现出更好的免疫效果。同时，本发明还提供一种病毒样颗粒极其制备方法，其优势在于：适于规模化生产、效价高、产物无需浓缩、纯化等工艺，节约成本，流程简单且安全。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒、病毒样颗粒及其制备方法。

背景技术

传统动物疫苗以全病毒灭活疫苗和弱毒疫苗为主，其生产必须依赖动物细胞、鸡胚、活体动物等基质，在产量上存在较大局限性，需要较高的成本，且培育过程易引入外源病毒，导致疫苗污染。此外，天然弱毒疫苗存在毒力返强风险，生物安全问题时刻存在。随着分子生物学的发展，高新技术疫苗已成为研究的前沿领域，以分子生物学技术的基本方法研究开发兽用新型疫苗是21世纪的主导方向。重组亚单位疫苗是用基因工程DNA重组技术将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达基因产物——蛋白质或多肽制成的疫苗，与传统疫苗相比较具有安全性高、纯度高，稳定性好以及产量高等优点，该类疫苗是目前使用最广泛的新型疫苗。以大肠杆菌生产亚单位疫苗较为常见，但依旧存在不足之处：由于其革兰氏阴性菌的特性，内毒素问题长期存在；表达的蛋白缺乏糖基化、磷酸化修饰，大大降低生物学活性，以上问题均对疫苗质量产生影响，生产上需找到新的替代菌种。

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease Virus,IBDV)感染引起的鸡急性、高度接触性传染病，是我国规定要严格防控的II类动物疫病。IBDV主要侵害雏鸡体液免疫器官法氏囊，损伤淋巴细胞，从而导致鸡的免疫机能障碍，进而增加对其他病原的易感件，甚至造成对其他疫苗的免疫应答能力下降。感染IBDV后，雏鸡群在短时间内大量死亡或鸡群产肉、产蛋等生产性能大幅度下降，带来直接经济损失。由于IBDV超强毒株的出现及环境因素、免疫程序等诸多因素的影响，鸡IBD在我国发病情况呈现新趋势：流行面积日益扩大、发病鸡群日龄变宽、伴随严重继发感染和并发症等。

除了严格的环境卫生制度外，疫苗的使用仍然是目前鸡IBD的主要防控手段，生产中应用最广泛的IBDV疫苗种类是灭活疫苗和弱毒疫苗。接种鸡胚后收获尿囊液是上述两类疫苗的传统生产方式，现也有使用鸡胚成纤维细胞(CEF)生产弱毒疫苗，但无论是使用鸡胚或是CEF,都存在SPF鸡胚消耗大、单位材料生产力低、生产周期长、总体生产成本高等天然问题。传统生产工艺的缺陷对IBDV疫苗的应用产生了一定的限制，不符合现阶段养禽业疫病防控、健康发展的需求，因此，迫切需要一种低成本、大规模、高效的IBDV疫苗生产方式适应行业的生产。

杆状病毒/昆虫细胞表达系统是近年来应用最多的表达系统。目前常被使用的Bac-to-Bac表达系统。转座后的重组杆状病毒载体质粒可在大肠杆菌和昆虫细胞内复制。该表达系统具有PPH和PP10两个超强的转录启动子，转录后期可高效表达外源蛋白，最高可达到细胞总蛋白表达量的50％。此表达系统最常用的细胞系主要为草地贪夜蛾卵巢(SF9、SF21细胞)和粉纹夜蛾卵巢(High Five细胞)。两种细胞均可用无血清培养基培养，避免支原体污染。

亚单位疫苗的应用已经成为畜牧行业的趋势，建立亚单位疫苗生产体系势在必行，杆状病毒/昆虫细胞表达系统具有突出的优势。本发明核心在于通过杆状病毒/昆虫细胞表达系统来表达禽法氏囊病病毒样颗粒，为大批量蛋白疫苗的生产提供可靠理论基础和技术支撑。