[发明专利]能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒、病毒样颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：扩增鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因后与pFastBac 1载体连接，连接产物转入DH5α感受态中，筛选阳性克隆获得重组质粒pFastBac 1-VP2，将测序正确的pFastBac 1-VP2转入DH10 Bac感受态中获得重组质粒Bacmid-IBDV-VP2；

步骤2：将Bacmid-IBDV-VP2转入SF9细胞，收获重组杆状病毒。

2.根据权利要求1所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤1中，鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)的VP2基因通过以下方法获取：

鸡传染性法氏囊病病毒IBDV(GT株)使用RNA抽提试剂盒提取RNA，使用反转录酶获得cDNA；

采用引物对cDNA进行PCR扩增得到扩增产物VP2基因，扩增体系为：50μL，其中，10×PCRBuffer 5μL,dNTPlμL，上、下游引物各lμL，cDNAlμL，pfu酶lμL，ddH2O40μL；dNTP中各类碱基的浓度为l0mM；上、下游引物的浓度均为l0mM；

PCR反应参数：95℃5min；94℃30s,57℃30s,72℃120s,30个循环；72℃10min；

上下游引物的序列分别为：

VP2—F:CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAA

VP2—R:CCCAAGCTTGAAGCCGAATGCTCCTGCAAT；

使用胶回收试剂盒将VP2基因进行回收。

3.根据权利要求1所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，VP2基因与pFastBac 1载体连接的方法为：

分别将胶回收后的VP2基因和pFastBac 1载体使用BamH I和Hind I I I双酶切，分别回收、纯化，将酶切后的VP2基因片段和pFastBac 1载体用T4连接酶16℃过夜连接。

4.根据权利要求1所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤2具体为：

取无血清悬浮培养的Sf9细胞，在摇瓶中悬浮转染，转染试剂与质粒Bacmid-IBDV-VP2混匀后，加入Sf9细胞悬液中在摇床中培养，当细胞活率降至60％时收获培养上清，即为P0代杆状病毒，对P0代杆状病毒进行扩增1-2次使其滴度超过10⁸TCID50。

5.一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的重组杆状病毒，其特征在于，采用如权利要求1-4任一所述的方法制备得到。

6.一种能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养，当细胞密度培养至5×10⁶-6×10⁶cells/ml，利用权利要求1-4任一所述的重组杆状病毒进行感染，全悬浮无血清培养5-7天，表达蛋白可形成病毒样颗粒。

7.根据权利要求6所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒，其特征在于，所述重组杆状病毒的滴度不低于10⁸TCID50。

8.根据权利要求6所述的能够表达禽法氏囊病病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养的参数为：

转速：120rpm；pH值：6.10±0.1；压缩空气通气量15ccm；氧气通气量30ccm；溶氧量50％；温度27℃。