[发明专利]一种碱基编辑器及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种碱基编辑器，所述碱基编辑器为PX459重组质粒，所述PX459重组质粒包括PX459‑U6‑sgRNA‑CBh‑T2A‑PURO载体骨架和rAPOBEC1(W90Y+R126E；YE1)‑SpCas9n(D10A)‑UGI核苷酸序列。所述碱基编辑器制备方法简便，且在应用中采用单质粒进行细胞转染操作，这样不仅可以提高基因编辑效率，能够特异的将将靶位点的胞嘧啶C突变成胸腺嘧啶T，而且对非靶位点的碱基没有任何影响，所述碱基编辑器应用领域广泛，不仅能够应用于猪体细胞基因编辑，还可应用到牛、羊等经济动物细胞基因编辑上。

技术领域

本公开属于基因编辑技术领域，具体涉及一种碱基编辑器及其制备方法和应用。

背景技术

基因编辑(gene editing)，又称基因组编辑(genome edting)或基因组工程(genome engineering)，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。当前CRISPR/Cas9是最常用的基因编辑工具，其原理是核酸酶导致DNA双链断裂(Double strand break,DSB)，诱导细胞激活同源重组(Homology-directedrepair,HDR)或非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)来修复DSB，修复的过程就能引入基因突变，实现基因敲除或敲入【1】。

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer)，简称“核移植”，是指将一个物种的体细胞移植到去核卵母细胞中，移入的供体细胞核在受体卵胞质中完成重编程，然后移植到代孕母体以生产新动物个体的技术【2】。由于细胞遗传物质包含在核内，得到的后代具有与核供体完全相同的遗传信息，因此体细胞核移植也被称为“体细胞克隆”(Somaticcell cloning)。由于体细胞克隆猪遗传信息全部来自供体细胞，因此对供体细胞进行基因编辑，再用基因编辑细胞进行克隆猪生产，就能得到表达预定表型的基因编辑动物。目前以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术结合体细胞克隆已经在包括猪、牛、羊在内的多种动物基因修饰上得到了广泛应用，短短几年内公开报道的以改良经济性状和疾病模型为目的的基因编辑猪就多达100多种，为农业生产和生物医学研究带来了强大助力【3】。

胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)是在传统CRISPR-Cas9系统中只具有单链切割能力Cas9n(D10A)蛋白上融合大鼠胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂UGI而成，该融合蛋白能够在单链向导RNA(sgRNA)的引导下特异性地针对靶序列C·G碱基对高效转化为T·A碱基对，实现单个碱基突变以改变基因功能【4】。相比CRISPR/Cas9而言，CBE由于仅针对目标区域的C碱基定向突变，不导致DSB，因而编辑结果能够实现预测，而应具有更高的精准度和安全性，势必在猪的遗传改良和疾病模型构建中得到更广泛的应用。研究表明CBE也存在广泛性基因脱靶这一重要不足。

参考文献：

[1]Hsu PD,Lander ES,Zhang F.Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.Cell,2014,157:1262-1278.

[2]Keefer CL.Artificial cloning of domestic animals.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2015,112:8874-8878.

[3]Zhao JG,Lai L,Ji W,Zhou Q.Genome editing in large animals:Currentstatus and future prospects.Natl.Sci.Rev.,2019,6:402-420.