[发明专利]一种碱基编辑器及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种碱基编辑器，其特征在于，所述碱基编辑器为PX459重组质粒，所述PX459重组质粒含有如SEQ ID NO.2所示的rAPOBEC1(W90Y+R126E；YE1)-SpCas9n(D10A)-UGI核苷酸序列。

2.根据权利要求1中所述的碱基编辑器，其特征在于，所述PX459重组质粒包括PX459-U6-sgRNA-CBh-T2A-PURO载体骨架和所述rAPOBEC1(W90Y+R126E；YE1)-SpCas9n(D10A)-UGI核苷酸序列。

3.根据权利要求2中所述的碱基编辑器，其特征在于，所述PX459重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1至3任意一项所述的碱基编辑器的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤为：

(I)用带有双酶切位点的引物对PX459质粒进行PCR扩增，回收PCR产物经双酶切获得的PX459-U6-sgRNA-CBh-T2A-PURO载体骨架；

(II)用带有双酶切位点的引物对YE1-BE4max-NG质粒进行PCR扩增，回收PCR产物经双酶切获得的rAPOBEC1(W90Y+R126E；YE1)-SpCas9n(D10A)-UGI核苷酸序列；

(III)利用DNA连接酶将PX459-U6-sgRNA-CBh-T2A-PURO载体骨架和rAPOBEC1(W90Y+R126E；YE1)-SpCas9n(D10A)-UGI核苷酸序列连接，获得所述PX459重组质粒。

5.根据权利要求4中所述的碱基编辑器的制备方法，其特征在于，进行双酶切所使用的酶为AgeI限制性内切酶和SalI限制性内切酶。

6.如权利要求书1至3任意一项所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：

(1)确定待编辑基因的靶位点；

(2)根据基因的靶位点合成gRNA引物，然后将gRNA引物进行高温退火形成引物二聚体；

(3)利用限制性内切酶将所述PX459重组质粒进行线性化，然后与引物二聚体混合后进行连接，获得连接产物；

(4)将连接产物进行转化感受态细胞，扩增培养后回收纯化质粒；

(5)将回收的纯化质粒进行细胞转染，进行传代培养；

(6)加入抗生素进行细胞的抗性筛选；

(7)撤除抗生素继续进行细胞培养，直至长出单细胞克隆。

7.根据权利要求6中所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，其特征在于，所述步骤(3)中限制性内切酶为BbsI限制性内切酶。

8.根据权利要求6中所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，其特征在于，所述步骤(5)中细胞转染是采用Lipofectamine 3000试剂进行细胞转染，优选的所述细胞转染的时间为6h。

9.根据权利要求6中所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，其特征在于，所述步骤(5)中细胞传代培养的密度为1万/35mm直径培养皿，优选的所述细胞传代培养的时间为2天。

10.根据权利要求6中所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用，其特征在于，所述步骤(6)中抗生素为嘌呤霉素；优选的所述嘌呤霉素的使用量为1μg/mL；优选的所述细胞抗性筛选的时间为72h。