[发明专利]一种快速检测桃枝枯病菌的LAMP引物组及其快速检测的方法和试剂盒

说明书

本发明属于植物病害防治技术领域，公开了一种用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增(LAMP)的引物组及其快速检测的方法和试剂盒。引物组合包括一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP。本发明还同时公开了一种用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增试剂盒，除了包含上述引物组合物之外，还有10×Thermopol Buffer、dNTPs、MgSO₄、甜菜碱、Bst DNA聚合酶。本发明以MTEF1基因保守区片段序列设计LAMP引物，并进行快速分子检测体系和反应条件的优化，能对桃枝枯病菌进行LAMP检测，反应过程简便、检测周期短。特异性强、灵敏度高，可用于肉眼观察检测结果，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明涉及植物病原物检测和植物病害防治技术领域，更具体地，涉及一种检测桃枝枯病菌的引物组及其快速检测的方法和试剂盒。

背景技术

桃枝枯病是危害桃树的一种重要病害，病原为桃拟茎点霉(Phomopsisamygdali)。近年来，该病在我国云南昆明、上海南汇、浙江嘉兴、江苏无锡和常州、四川成都等南方桃产区陆续发生并迅速蔓延，发病桃园平均损失20％～50％，部分发病比较严重的桃园面临绝收的危险。该病害可以通过菌丝在田间病枝、土壤表层和土壤耕作层病枝残体上越冬；3月初平均气温达到10～15℃时病斑部位产生分生孢子器及分生孢子。分生孢子从3月下旬遇开始释放，释放高峰期为月3下旬到5月上旬，分生孢子释放与气温、降水量有关，雨水飞溅有助于分生孢子释放、传播和侵染。

基于该病的扩展和蔓延，桃园枝枯病的监测和病害早期检测工作非常重要，病原确定后，可以采取有效的针对性措施进行病害预防和防控，将能大大减少病害的发生及其危害。因此，桃枝枯病菌的快速检测，对该病的防治特别是预防尤为重要。此外，桃枝枯病菌在桃树上存在“潜伏侵染”状态，一旦潜伏的共生状态转换成致病状态，即可形成肉眼可见的病斑，再采取防治措施，为时已晚，防治效果会很不理想。所以要高效的防治桃枝枯病，在潜伏的共生状态的早期快速检测就非常重要，这也将是建立桃枝枯病预警防治技术的基础。

随着核酸相关的的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测桃枝枯病菌，但PCR特异性等检测耗时偏长，需要3～4h，同时PCR方法需要昂贵的PCR仪，且检测灵敏度偏低，且过程较繁杂。此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩增，这是实验室污染的一个重要来源，而且溴化乙锭(EB)剧毒，可累积致癌，对人体产生巨大危害，长期观察紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有问题，提供一种用于田间快速检测桃枝枯病的试剂盒及其应用，可用于快速检测桃树中的桃枝枯病。所述的方法具有快速、灵敏、特异性强等优势，结果可靠稳定。也在于开发配套使用的试剂盒，使田间技术人员实时掌握桃枝枯病的发生状况，做好预防及治理病害的准备。

为解决现有检测桃枝枯病菌技术存在的不足和缺点，本发明提供了一种桃枝枯病田间快速检测试剂盒，它是在田间快速判断桃枝枯病病菌是否已侵染桃树的试剂盒，可在很快的时间内检测出结果，具有快速、特异、灵敏、高效等特点。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测桃枝枯病的靶向序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测桃枝枯病特异性LAMP的反应引物组。

本发明的第三个目的是提供一种快速检测桃枝枯病菌的方法。

本发明的第四个目的是提供一种检测桃枝枯病的试剂盒。

本发明针对我国桃枝枯病菌(Phomopsis amygdali)来设计特异性检测LAMP 引物组，通过前期获得的全基因组序列，筛选得到特异性检测基因，具体地，靶标序列如图1所示。

针对上述目的是通过以下方案实现的：

一种用于检测桃枝枯病菌的靶向序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。