[发明专利]一种快速检测桃枝枯病菌的LAMP引物组及其快速检测的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测桃枝枯病菌的靶向序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的靶向序列在检测桃枝枯病菌或制备桃枝枯病菌的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求1所述的用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合由以下四条引物组成：

F3：CGTCCCTTTCTGCTCTTCAC；

B3：CTATATCGAGCCGGGAGGA；

FIP：ATGGAATTCGGGCCTTCGCCGACTCTCTCAGCATCAGCCT；

BIP：TCATCTTATCCACCACGCTGCGCGCAACCCGTGACTTCTC。

4.用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含由权利要求3所述的LAMP引物组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组合包括：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反内向引物BIP，0.2μM的正外向引物F3，0.2μM的反外向引物B3。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含：8U/μL Bst聚合酶、10×ThermoPol buffer、dNTPs、甜菜碱(Betaine)、MgSO₄、SYBR Green I核酸荧光染料、ddH₂O。

7.用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述方法采用以下的反应体系：8U/μL Bst聚合酶1μL、10×ThermoPol buffer 2.5μL、10μM FIP4μL、10μM BIP 4μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、10mM dNTPs 2μL、5mM甜菜碱3μL、100mM MgSO₄ 1μL、ddH₂O补足至25μL，反应结束加1μL SYBR Green I核酸荧光染料。

8.根据权利要求7所述的用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于，利用所述反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：

方法一：先在扩增后加入SYBR Green I核酸荧光染料作为反应指示剂，以SYBR GreenI核酸荧光染料颜色变化作为结果判定标准，颜色结果为绿色为阳性，判断检测到桃枝枯病菌；颜色显示橙色，表示阴性，判断指示样品无桃枝枯病菌，或所含的桃枝枯病菌的量未达到最低的检测限浓度；

方法二：取5μL的扩增产物，用1％的琼脂糖胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到桃枝枯病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示没有检测到桃枝枯病菌，或所含桃枝枯病未达到最低检测浓度。

9.根据权利要求7所述的用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于，LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min。

10.根据权利要求8所述的用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述LAMP扩增反应中的最低检测浓度为0.01ng/μL。