[发明专利]一种快速扩增体外NK细胞的方法

说明书

本发明属于生物医药领域，涉及一种NK细胞快速扩增的方法。所述的方法包括：分离纯化NK细胞；制备IL‑15和4‑1BBL蛋白分子；构建含有I53‑50A和I53‑50B蛋白的纳米颗粒；将IL‑15、4‑1BBL蛋白分子和含有I53‑50A和I53‑50B蛋白的纳米颗粒加入NK细胞的培养基质。本发明制备出可以高效刺激NK细胞扩增的纳米级别的细胞因子颗粒，可以在较短的时间内完成NK细胞的快速高效的扩增，操作简单、成本低廉、无污染，所获得的NK细胞分离提纯时也快速简便。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种NK细胞快速扩增的方法。

背景技术

NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，也会参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。一般认为，NK细胞直接从骨髓中衍生，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。小鼠和人的体外实验表明，胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC 5-0%，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。小鼠脾脏在体内IL-3诱导下可促进NK细胞的分化。

由于NK细胞具有部分T细胞分化抗原，如80%NK细胞表达CD2+，20%NK细胞C表达D3+(表达CD3ζ链)，30%NK细胞表达CD8+(α/α)和75%NK细胞表达CD38+，而且NK细胞具有IL-2中亲和性受体，在IL-2刺激下可发生增殖反应，活化NK细胞可产生IFN-γ，因此一般认为NK细胞与T细胞在发育上关系更为密切。

目前NK细胞的抗肿瘤效果在多种血液病恶性肿瘤的临床治疗中已获得了良好的治疗效果。如何有效的获得NK细胞并且快速扩增是利用NK细胞进行细胞治疗的关键。

目前用于细胞治疗的临床级NK细胞主要来源于自体分离的NK细胞，在体外通过细胞因子（IL-15，4-1BBL）和饲养层细胞促使NK细胞在2周左右快速扩增，获得纯度较高的NK细胞。当前的做法大部分是采用细胞因子铺板或者是磁珠的方法刺激NK细胞的扩增，但是这些方法的弊端是扩增效率不高，或者是磁珠分离后总会有残留，影响后续的产品的纯度。

前期研究表明，I53-50a和I53-50B分子是天然存在的一对蛋白，可以自组装成20-40nm的纳米颗粒（Science，22 Jul 2016:Vol. 353, Issue 629）。

发明内容

本发明目的是提供一种体外快速而特异的扩增NK细胞的方法。

本发明再一目的在于：提供一种构建扩增NK细胞所用的纳米颗粒。

本发明的又一目的在于：提供一种构建扩增NK细胞所用的试剂。

本发明通过调整I53-50a和I53-50B以及细胞因子的种类和数量，优化自组装蛋白的纳米颗粒结构，可实现多种细胞因子组装形成三维立体的纳米颗粒结构，从而建立一套NK细胞的分离和扩增的方法，包括从PBMC（或以磁珠分离的NK细胞）为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异扩增的方法，获得NK细胞，并且建立基于细胞因子的NK细胞的快速扩增技术。

本发明提供了一种NK细胞快速扩增的方法，制备了一对自组装肽的结构，实现了多种细胞因子组装成了三维的纳米颗粒结构，营造了体内细胞扩增的三维环境，有利于NK细胞的快速扩增。

一方面，本发明提供了一种扩增NK细胞的方法，所述的方法包括：

分离纯化ＮＫ细胞；

制备IL-15和4-1BBL蛋白分子；

构建含有I53-50A和I53-50B蛋白的纳米颗粒；和

将IL-15、4-1BBL蛋白分子和含有I53-50A和I53-50B蛋白的纳米颗粒加入NK细胞的培养基质。