[发明专利]新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒

说明书

本发明属于生物医学技术检测领域，具体涉及一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒。针对目前二代测序存在的问题，本发明提供了一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒。本发明将化学合成的DNA片段的PCR扩增产物作为待测样品的标准，然后用DGGE技术对作为标准的DNA片段及阳性待测样品进行检测，从而实现对新冠肺炎病毒分型及突变位点的快速检测。本发明在保证检出率的基础上，操作简便快捷，时间短，成本低，在实验室易普及；同时检测具有特异性强、肉眼可直接判读和不依赖大型实验设备等优势，为快速准确检测新冠肺炎病毒的突变提供了简便、易操作、耗时短的平台。

技术领域

本发明属于生物医学技术检测领域，涉及一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒。

背景技术

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引发新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)的病原体。该病毒是一种具有29903个核苷酸的单链RNA-β冠状病毒。国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。世界卫生组织(WHO)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19。

该病毒在不到4个月的时间内就散布在210多个国家中，截至2020年6月28日，全世界报告的确诊病例超过1000万，死亡人数近50万。随着病毒的传播，其基因序列已经突变，世界各地出现越来越多的变异菌株，在相关统计中，收集到的48635个SARS-CoV-2完整基因组样品与原始病毒株相比，在每个样品中平均存在7.23个突变。其中单核苷酸突变是主要的突变类型，最突出的是SARS-CoV2 Spike蛋白中的D614G突变，实验表明：携带D614G突变的S-病毒在转导细胞上的效率比野生型S-病毒高8倍，D614G与另外三个突变组C14408T、C241T和C3037T这四个突变几乎总是在同一基因组中同时发生，从而定义了在病毒种群中观察到的主要进化枝G。同时还存在着其余的进化枝GH、GR。

所以，对于突变菌株的鉴定分类与追踪溯源显得尤为重要，目前在分子生物学检测手段上，基因测序最常用的方法。二代测序虽然操作简便，但测序成本贵，测序错误率高，同时依赖大型科研仪器与专业的生物信息分析人员，检测周期也比较长。因此需要一种快速准确检测突变的方法，用于检测临床标本中SARS-CoV-2病毒核酸突变序列。

当前，已有利用携带荧光报告基团探针检测新型冠状病毒两个碱基突变(8782C→T和28144T→C)的技术，但该技术所需试剂价格昂贵，单次实验耗量高，有效使用次数少，不适宜进行多次批量实验，并且灵敏度较低。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是为建立一种实现高效、快速、准确且经济的新冠肺炎病毒突变位点快速检测方法，本发明公开了一种PCR-DGGE检测突变的试剂盒和检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明提供一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的引物组及DNA片段，所述引物组(带GC夹子)包括：GC+C241T-F、C241T-R、GC+C3037T-F、C3037T-R、G11083T-F、G11083T-R、GC+C14408T-F、C14408T-R、GC+A23403G-F、A23403G-R、GC+G25563T-F、G25563T-R、GC+GGG28881AAC-F、GGG28881AAC-R，其序列依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示；GC夹子的加入，确保了发生在DNA片段中每个碱基处的序列差异都被区分开来。